09实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化摘要.pptVIP

* 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验九 实验学时：6 学时 实验类型：综合性 每组人数： 4 人／组 细菌处于0℃，0.1M CaCl2低渗溶液中，使菌细胞膨胀成球形，处于容易吸收外源DNA的状态，该状态称为感受态。 一、实验原理 感受态的本质与存在可能局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点， 使DNA分子能进入细胞。 1 感受态细胞的制备 DH5α　菌株 一种常用于质粒克隆的菌株。其 j80lacZ△M15基因的产物可与pUC载体编码的b-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1 和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 (一)仪器 1．小型高速离心机 2．恒温摇床 3．恒温箱 4．-70℃冰箱 5．恒温水浴器 二、仪器、材料与试剂 (二)材料 1．氨苄青霉素 2．大肠杆菌DH5α 3.pBluescriptM13 4．1.5mL 离心管 5 吸头、移液器（枪） 6．试管、培养皿 (三)试剂 1．0.1mol/L CaCl2 溶液 2．LB液体培养基 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置-20℃冰箱保存。 1．从大肠杆菌DH5α 的平板上挑取一个单菌落接于2mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取1mL菌液转接到一个含有100mLLB液体培养基1L锥形瓶中，37℃振荡培养2~3h。(此时，OD600 0.4~0.5，细胞数务必＜108/mL，此为实验成功的关键)。（以上两步已经由老师做好） 3. 将细菌转移到无菌﹑预冷的1.5mLEP管中,冰上放置10min 。 三、实验步骤 4. 4℃,4000r/min,10min。 5. 倒出培养液,将管倒置1min使培养液流尽。回收细胞。 6. 用1mL预冷的0.1moL/L CaCl2溶液重新悬浮细胞。 7. 重复步骤4 。 8. 重复步骤5 。 9. 每管用200ul 预冷的0.1moL/L CaCl2重新悬浮细胞。 可直接转化（也可冻存于-70℃） 。 E.coli DH5a 2mL LB 37℃振荡 过夜 1mL 菌液 100mlLB 2-3hrs 37℃振荡 菌液 50mL聚丙烯管 无菌 预冷 冰浴 10min 收集细胞 10min 4℃,4100r/min 弃上清 倒置1min 30mL 0.1M CaCl2 悬浮细胞 重复2次 2ml 预冷 0.1M CaCl2 重悬细胞 200ul 1.5mlEP 分装 冻存-70℃ 转化 １０μl 40ng DNA 混匀、冰浴３０min ４２℃,９０s 水浴 冰浴２min 800μl ＬＢ ３７℃ ４５min 涂平板(Ampr) ３７℃,１２～１６hrs 观察结果 实验目的及背景 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是PCR体外扩增DNA所不能替代的。配合DNA重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。 2 转化 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 DNA分子转化分以下几步: ①吸附－－双链DNA分子吸附于受体菌表面； ②转入－－双链DNA分子解链,一条链进入受体菌,另一条降解； ③自稳－－外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链； ④表达－－供体基因随同复制子同时复制，分裂,转录翻译。 *