第14章基因重组和基因工程--本科重点.pptVIP

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 克隆是人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步。 原是英文clone的音译，意为生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群，简称为“无性繁殖”。 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 Klenow片段：DNA聚合酶Ⅰ大片段 逆转录酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 3’突出粘性末端 （三）目的基因(target gene) （??） cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章) 概念：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救。 例如： λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 线性双链DNA分子，大小约50kb。 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 柯斯质粒载体 (cosmid vector) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 3.其他 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 二、重组DNA技术基本原理（??） 目的基因的获取 DNA导入受体菌 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 已知目的基因的核苷酸序列 已知基因产物的氨基酸序列 。 化学合成法 推导出编码基因核苷酸序列 化学合成仪 合成目的基因 一般用于小分子活性多肽基因的合成。如胰岛素原、 干扰素基因等。 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 以mRNA为模版，反转录合成cDNA ，与载体拼接后导入受体菌，即获得cDNA文库。由总mRNA 制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的基因。目前发现的多数蛋白质的编码基因都是如此分离的。 从cDNA文库获取目的基因 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T （二）克隆载体的选择和构建 外源DNA片断离开染色体是不能复制的，必须借助载体，随载体的复制而复制，重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一种极富技术型的专门工作，目的不同、操作基因的性质不同载体的选择和改建方法也不同。 （三）外源基因与载体的连接 粘性末端连接 即DNA的体外重组，靠DNA连接酶将外源基因与载