PCR原理及其操作教材.pptVIP

PCR（Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链反应，又称DNA体外扩增技术。 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明的一种具有划时代意义的分子生物学技术，被誉为无细胞分子克隆。 PCR引物 为DNA片段 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 ＲＴ－ＰＣＲ（逆转录-PCR） 组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物或基因特异性的引物（GSP）利用逆转录酶反转录成cDNA.再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达. RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能. 该技术主要用于:分析基因的转录产物,获取目的基因,合成cDNA探针,构建RNA高效转录系统. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离 。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。 miRNA MicroRNA (miRNA)是近年来发现的小分子调节RNA,由约22个内源性非编码的核苷酸组成,可以和与之互补的信使RNA (mRNA)结合抑制其翻译或促进其降解,对mRNA的稳定及翻译效率起到重要的调控作用,从而实现对基因表达的负性调节效果。1993年Lee等在新小杆线虫和果蝇中发现了第一个miRNA并命名为lin-4; 2000年Reomhart等在对线虫发育调控的研究中发现了 let-7从而拉开了 miRNA的研究序幕。MiRNA不仅参与调控机体的多种生理过程,如细胞的新陈代谢、增殖分化、生长凋亡等,而且在众多疾病的I发生发展中起重要的调控作用。 miRNA的成熟 Pre-miRNA miRNA与靶mRNA的作用模式 miRNA的调控特点 PCR的基本原理 试管中进行的DNA复制反应，依据 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链DNA变成单链， 单链DNA与人工合成的引物退火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 PCR反应体系 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 　　　　 各10～100pmol 模板DNA 　　　 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 　　　　　 1.5mmol/L PCR的基本步骤 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s） PCR的基本步骤 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 PCR的基本步骤 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 低温退火 2 高温变性 1 适温延伸 3 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA变性 形成2条单链 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 高温变性 低温退火 中温延伸 PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。 此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。 理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。 实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。 由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。 以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。 PCR扩增曲线 PCR反应五要素 1. 引物（primer） 2. 酶 （Taq DNA polymerase） 3. dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4. 模板 （template） 5. Mg2+