全血胆碱脂酶测定预案.pptVIP

全血胆碱酯酶活性的测定 实验目的 掌握全血ChE活性测定的意义 掌握全血ChE活性测定原理、方法 方 法 Asch-DTNB比色法（GBZ52） 三氯化铁比色法 溴麝香草酚蓝（B·T·B）比色法 纸片法 Biocheck法（便携式分析仪） 三氯化铁比色法 [原理] 三氯化铁比色法 [原理] 实验器材 一次性注射器(1ml) 12个，采血用； 微量移液器（20μl）；分光光度计； 玻璃比色杯(每组至少3个)；擦镜纸； 恒温水浴箱（37℃±0.5 ℃ ） 移液管(0.2ml，1ml，5ml)； 试管；漏斗；容量瓶 试剂 试剂均为分析纯，水为蒸镏水或去离子水。 1．磷酸盐缓冲溶液，pH=7.2 准确称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H2O)16.72g和磷酸二氢钾(KH2PO4)2.72g，用水溶解并稀释到1000ml，置4℃冰箱中保存。 2．碱性羟胺溶液 临用时将139 g/L的盐酸羟胺溶液与140 g/L的氢氧化钠溶液等体积混合。 3．盐酸溶液1+2 浓盐酸l份加水2份混合。 试剂 4．三氯化铁溶液 (100 g/L) 称取10g三氯化铁(FeCl3·6 H2O )，加浓盐酸0.84ml，溶解后再加水至100ml，贮存于棕色瓶中。 5．氯化乙酰胆碱标准溶液 (1)标准贮备液：精确称取氯化乙酰胆碱1.2716g，用pH=7.2的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至100ml。此溶液1ml含70 μmol乙酰胆碱。置4℃冰箱内保存。 (2)标准应用液：取标准贮备液用磷酸盐缓冲液稀释10倍。此液1ml含7 μmol乙酰胆碱，于临用前配制。 [分析步骤] 1. 乙酰胆碱标准曲线的绘制 2. 样品测定 （2）各管加碱性羟胺4ml，立即振摇2 min （3）各管加1∶2盐酸溶液2ml，振摇2 min （4）各管加10%三氯化铁溶液2ml，摇匀，过滤 （5）测吸光度:λ=520nm，参比管-第1管 （6）绘制标准曲线 计 算 1.被水解 的乙酰胆碱吸光度= 对照管吸光度（B管）－ 样品管吸光度（A管） 2.对照标准曲线，得出被水解的乙酰胆碱( μmol ) ---即0.02ml血经37 ℃，30min反应条件下的 胆碱酯酶活性绝对值C 3.胆碱酯酶活性相对值（%） 注意事项 采血前先准备好试管，加入磷缓 采血时严格消毒，用过的棉球、刺针集中放置 准确控制水浴温度和放置时间 加三氯化铁显色后，在20min内比色 参比管的溶液留用到最后 实验报告要求 [实验目的] [实验原理] [实验步骤] [实验结果] [分析与讨论] * * ——三氯化铁比色法 乙酰胆碱 胆碱酯酶 胆碱 + 乙酸 碱性羟胺 乙酰羟胺 HCl FeCl3 羟肟酸铁(棕红色络合物) 血液中胆碱酯酶可使乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸，终止反应后，剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺作用生成乙酰羟胺，然后在酸性环境中与三氯化铁反应生成棕红色羟肟酸铁络合物。其颜色深浅与乙酰胆碱的量成正比，在520nm进行比色定量，从而推算出胆碱脂酶活性。 1.乙酰胆碱标准曲线的绘制 （1）取六只具塞试管，配制不同浓度的乙酰胆碱溶液 7.0 5.6 4.2 2.8 1.4 0 乙酰胆碱含量（μmol） 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2 磷酸盐缓冲液（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 乙酰胆碱标准应用液（ml） 6 5 4 3 2 1 管号 2.样品测定 A管（样品管） B管（对照管） 0.98ml 磷酸缓冲液 0.98ml 磷酸缓冲液 20 μl 血 20 μl 血 37℃水浴 5min 碱性羟胺4ml, 振3min 乙酰胆碱标准应用液1ml 乙酰胆碱标准应用液1ml 37℃水浴 30min（准确计时） 碱性羟胺4ml,振3min 1∶2盐酸溶液2ml, 摇1min 10%三氯化铁溶液2ml 摇匀、过滤、比色 浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值 男：3.22 ±0.336 μmol 女：3.19 ±0.398 μmol *