基因工程(操作程序)重点.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2、基因枪法 花粉管 卵细胞 3、花粉管通道法 受精后 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 （三）将目的基因导入动物细胞 显微注射法 三、将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 将目的基因导入 微生物细胞 ——制备感受态细胞 四、目的基因的检测与鉴定 目的基因的部分片段 CGAACCGTAT 标记 探针 分子杂交技术：确定单链核酸碱基序列的技术。 基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（探针）间通过碱基互补配对形成可检出的双螺旋片段。 ATCGAACCGTATCG TAGCTTGGCATAGC GAGACCTTAACGT C TC TGGAATTGCA CGAACCGTAT CGAACCGTAT TAGCTTGGCATAGC 标记 探针 （+） 阳性对照 （—）阴性对照 1 转基因个体的DNA（实验组） （+）（—） 1 ：目的基因 ：非转基因个体的DNA DNA分子杂交检测结果 蛋白质检测 蛋白质检测： 利用抗原-抗体杂交： 被检测物是蛋白质， “探针”是抗体 四、目的基因的检测与鉴定 存在与否 分子水平检测 分子杂交技术 抗原-抗体杂交 表达与否 mRNA 蛋白质 ：DNA 四、目的基因的检测与鉴定 存在与否 分子水平检测 个体水平鉴定 分子杂交技术 抗原-抗体杂交 ：检测性状及产品活性等 表达与否 mRNA 蛋白质 ：DNA 棉花作为重要的经济作物，一直饱受棉铃虫的危害，造成巨大的经济损失。研究发现某种杆菌可以产生一种对抗此种害虫的蛋白质。利用基因工程的方法，我们如何改良棉花。请你提出基本方案。 归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法等 目的基因的检测与鉴定 分子水平：DNA是否插入、转录、翻译 个体水平 深入思考： 1、PCR扩增之后，是否成功获得了目的基因，如何检测？ —2000bp —1000bp —750bp —500bp —250bp —100bp 15000bp 10000bp 7500bp 5000bp 2500bp — 1000bp — 250bp — —11.2kb 酶切质粒载体电泳结果 PCR目的基因片段电泳结果 复制起始位点 标记基因 多个限制性内切酶酶切位点 EcoRⅠ EcoRⅠ SmaⅠ 2、所用的限制性内切酶如何选择？ 3、如果目的基因是没有启动子和终止子，需要载体上带有，为了防止倒连可以如何操作呢？ 4、如果目的基因两端没有合适的酶切位点，我们能通过什么方法给目的基因两端加上酶切位点呢？ 5、如何提高目的基因与载体连接的比例？加大DNA连接酶的用量有用么？ 分子杂交技术 根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 基因工程的基本操作程序 目的基因 　　开发人们特殊需要的基因，即目的基因（优良性状的基因、致病基因）。发达国家激烈竞争的焦点，有限的战略性资源，可申请新基因专利。 　　已获目的基因大致种类：与医药相关的基因；抗病、虫害和恶劣环境的基因；编码特殊营养价值的蛋白或多肽基因。 重组人胰岛素 （Humulin优泌林） 1982年10月全球第一个商业化基因重组人类胰岛素在美国上市 思考1： 如何利用大肠杆菌来生产重组人胰岛素？ 1、从基因文库中提取（不知目的基因序列） 某生物体内全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 限制酶 与运载体连接 导入 基因组文库 部分基因文库（cDNA文库的构建） cDNA 反转录 受体菌群体 与运载体连接 导入 某种生物某个时期的mRNA 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 基因组文库与部分基因文库的关系 2、利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。 循环 变性 退火 延伸 能否根据