碱裂解法提取质粒重点.ppt

碱裂解法提取质粒DNA 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及操作。 一、实验目的 质粒(Plasmid) ： 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 二、实验原理 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，具有以下特点： 易于鉴定； 在受体细胞中可以独立复制； 易于筛选； 易于导入受体细胞。 二、实验原理 高碱 细菌的细胞壁破裂，内容物释放 ①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA； ②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 ①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。 高酸中和至中性 变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物 质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 纯化 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质 SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。 三、主要试剂及作用 溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成 (保护、缓冲) 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械剪切作用,防止破坏质粒 (保护作用) EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用） Tris-HCl 使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用） * 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） * 溶液III：HAc和 KAc组成的高盐溶液 (复性，分离) HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。 KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。 四、试剂配制 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。 1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min ，贮存于4℃。 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。 5. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 6. 乙醇（无水乙醇、70%乙醇） 7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。 8. RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。 实验步骤 加1.5ml培养物于EP管，12000g×30S ? 除去上清，加入冰的200 μl 溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min ? 加入300μl 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min ? 加入400μl 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min 转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3m