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第二章 核酸的分离纯化 DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象 DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作 核酸分离纯化的原则: 保持核酸一级结构的完整性 尽可能提高核酸制品的纯度 第一节 核酸分离纯化的设计及原则 （一） 材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、 产量及浓度有不同的要求。 需考虑制备核酸所需的时间与成本 应选择安全的试剂与制备方案 （一）核酸的释放 DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。 应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等 2.非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸最常用的方法 常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁 常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除 紫外分光光度法： 核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。 荧光光度法： 核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。 紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。 荧光光度法： EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核 酸制品的纯度。 琼脂糖凝胶电泳： 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性 基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状 完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条 带荧光强度应呈特定的比值。 沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高 沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解 若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染  溶于TE缓冲液中的DNA在-70℃冰箱可保存数年。 TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低 7.0时DNA易变性。 2.RNA的保存 第二节 真核基因组DNA的分离纯化 一、酚抽提法 1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法 以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞 经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提，获得DNA粗制品 二、甲酰胺解聚法 1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。 三、玻棒缠绕法 玻棒缠绕法是在Bowtell(1987)方法的基础上经改进而来 四、其它方法 有些分子诊断技术并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法广泛使用。 1.异丙醇沉淀法 2.玻璃珠吸附法 五、 DNA片段的纯化 常用的纯化方法： 有机溶剂抽提法 柱层析法（column chromatography） 六、 DNA片段的回收 原则与要求: 1.提高片段的回收率 2.清除回收的DNA样品中的杂质 （一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 （二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。 第三节 质粒DNA的提取与纯化  质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。 质粒特性 1. 分子相对小 2. 含有高效的自主复制成分 3. 不相容性 4. 转移性 5. 选择的标记 6. 限制性内切酶单一切。 质粒DNA的提取和纯化 1．细菌的培养 ?? 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒