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浙科版选修3《现代生物科技专题》问题释疑 宁波效实中学 邵江樵 基因工程 5．PCR过程中退火（复性）温度的确定依据 * 2008－10 1．限制酶和质粒都是只存在与细菌中吗？ 不是。 不但细菌中存在限制酶和质粒，在酵母菌中也有限制酶和质粒。 基因工程 微生物中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。 微生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列(类似于人体的凝集原于抗凝集素的关系)，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基（A、C）上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管微生物中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 2．为什么微生物中的限制酶不剪切自身的DNA？ 基因工程 GAATTC CTTAAG 3．限制酶所识别的序列有什么特点？ 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列(回文结构)的。 EcoRI 基因工程 4.限制酶的组合使用（双酶切）问题 (2008海南生物卷)图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI（G↓AATTC）、BamHI （G↓GATCC）的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。 （1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化。 （2）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时 。 基因工程 同一种限制酶→相同限制酶（P6） 目的基因 AATTC G CTTAA G 目的基因 AATTC G CTTAA G 目的基因 AATTC G CCTAG G 目的基因 AATTC G CCTAG G 仅用限制酶EcoRI（G↓AATTC）切割： 限制酶EcoRI（G↓AATTC）和BamHI （G↓GATCC）联合切割： G CTTAA GATCC G 质粒 目的基因 AATTC G CCTAG G PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。 表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？____。 PCR过程包括变性→退火→延伸三个步骤，退火温度一般低于引物本身变性温度5℃，一般退火温度40～60℃之间。 而变性所需的加热温度取决于引物本身双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。对表1的引物对A和B比较可知，引物对A的两条链中A、T两种碱基的比例高，引物对B的两条链中G、C两种碱基的比例高，所以退火时引物对B的温度要求较高。 基因工程 6.双标记基因问题 下图a示基因工程中经常选用的载体——pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。为了检查载体是否导入原本没有Ampr 和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）。再将灭菌绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果（空圈表示与b对照无菌落的位置）。 a b Ampr Tetr c 基因工程 7.目的基因表达的检测方法怎样？ ①检测目的基因是否转录出了mRNA ②检测目的基因是否翻译成蛋白质 （2）常用的技术： ①利用DNA-RNA分子杂交看否生成了相应mRNA; ②用抗原－抗体发生特异性结合看是否合成了相应的蛋白质; ③从个体水平看是否表现出特定的性状，如用棉花叶喂虫，看虫食用后是否死亡判断抗虫基因在棉花植株上的表达。 目的基因 相应的蛋白质 mRNA 翻译 转录 基因工程 插入哪一条染色体、插入某一染色体的位置都是随机的，还有可能破坏正常基因的结构和功能，使受体细胞不能完成某项生命活动甚至死亡。 8．目的基因插入动植物细胞基因组的随机性问题 基因工程 糖蛋白是蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网上加工完成的。内质网存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这种细胞器，因此，由大肠杆菌中