生物药物分析与检验 氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验.pptVIP

第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 至少应用两种以上的方法，而且是两种不同分离机理的方法来判定蛋白质的纯度才比较可靠。 常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在离子色谱中却分辨为二个组分，反之亦然。 又如一种样品用凝胶过滤法和SDS电泳证明是纯的，但这仍不充分，因为这两者机理相同。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 三、蛋白质类药物的鉴别和检查 1、蛋白质类药物的鉴别 蛋白质类药物可根据其各自的物理、化学性质、生理作用等采用不同的方法进行鉴别。 （1）茚三酮反应 组成蛋白质的氨基酸都能与茚三酮反应生成紫色化合物，因此蛋白质也有此反应，这是蛋白质鉴别的最常用方法。 （2）福林酚反应或双缩脲反应 这两种常用来测定蛋白质的含量，但有时也用于蛋白质的鉴别。 （3）紫外吸收 由于组成蛋白质的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外区的光吸收特性，因此可利用此种特性鉴别蛋白质。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 五、蛋白质含量测定和效价测定 1、蛋白质含量测定 蛋白质的定量可用化学方法如凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚法、紫外光吸收法来测定；也可用染色法，如氨基黑、考马斯亮蓝测定；此外还可用荧光激发、氯胺T、放射性核素计数等灵敏度较高方法。 上述方法中凯氏定氮法、福林酚法、紫外光吸收法最为常用，它们操作简单、设备便宜。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 （1）凯氏定氮法 凯氏定氮法常用来测定有机物的含氮量。 ①原理：A、含氮有机物的消化 当含氮有机物与硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳、水。 氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。 分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进反应，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高沸点。 过氧化氢也能加速反应。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 B、铵离子的生成 消化完了以后，在凯氏定氮瓶中加入强碱（氢氧化钠溶液）消化液，使硫酸铵分解，放出氨。 用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。 C、测定 用强酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。 所用强酸的摩尔数即相当于被测样品中氨的摩尔数。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 （2）紫外吸收法 ①280nm光吸收法 由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质在275～280nm波长处有一个紫外吸收高峰，在一定范围内，蛋白质溶液在280nm波长处的光吸收度值（A280）与其浓度成正比，因此可作定量测定。 该法测定范围为0.01～0.1mg/mL。 该法简单、灵敏、快速、不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定，因此在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 ②280nm和260nm光吸收差法 若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在用来测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。 由于核酸在260nm波长处的光吸收比280nm波长处更强，因此可利用280nm和260nm的吸收差来计算蛋白质浓度。 常用下列经验公式估算： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280－0.74A260（假设1mg/mL蛋白质溶液的A280为1.0） 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 （3）考马斯亮蓝G-250染色法 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色，可在595nm波长处进行比色测定。 该法反应快、操作简便、消耗样品少，但不同蛋白质之间差异较大，且标准曲线线性较差。 测定范围为0.01～1.0mg/mL蛋白质。 高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去垢剂对测定有干扰，缓冲液浓度过高或改变测定液的pH也会影响显色。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 A、溶液的配制 标准蛋白质溶液 0.1或1.0mg/mL牛血清白蛋白。 染色液 称取100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50mL 95％乙醇中，加100mL 85％的磷酸，加水稀释到1000mL。该染色液可保存数月。若不加水可长期保存，临用前再稀释。 B、标准曲线 在试管中分别加标准蛋白质溶液0、6、12、24、36、48、60μL，用水补足至60μL，加3mL染色液，混匀后在室温（20～25℃）保温15min，在595nm波长处进行比色测定，以标准蛋白质浓度为横坐标，以吸收度值为纵坐标作标准曲线。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 C、样品测定 取60μL样品溶液同上测定，然后从标准曲线上查得其浓度。 当样品中蛋白质浓度较稀时（0.01～0.1mg/mL），可在3ml染色液中加0.3mL样品溶液，同时作标准曲线，测595nm波长处的光吸收度值。 0.05mg/mL牛血清白蛋白溶液的