生物化学与分子生物学实验(终版)重点剖析.pptVIP

实验内容 生物化学实验基本操作 实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量 实验二 血清丙氨酸氨基转移酶的测定 （三）刻度吸管的使用 3、使用注意事项 （1）选管：所用吸管规格最好应稍大于或等于所吸的液体量。 （2）抹管尖：在吸血清、标准液时，应用滤纸抹去管外多余的液体。 （3）吹管：刻度吸量管注明“吹”字的应吹出残液。 （4）读数：液体弯液面的最低点、刻度线上缘与视 线在同一水平上。 （5）洗管：吸血清的吸管，应及时洗清。 （四）溶液的混匀 1、指弹法 2、旋转混匀法 3、颠倒混匀法 4、涡旋振荡器混匀法 5、玻棒搅拌混匀法 （五）分光光度计 （1）透光率（T）和吸光度（A） 2、定量分析方法 （1）标准曲线法 （2）标准对比法（三管法） 光的互补示意图 4、分光光度计的基本结构： 5、722型分光光度计的操作方法 接电源，开开关，预热30分钟（打开暗盒）； 选波长，选择开关置于“T”，“调0”点； 盛空白，装样品，关暗盒，调 “100%”； 将选择开关置于“A” ，拉动拉杆，记读数； 取出比色杯，关上暗盒及开关，拔掉电源； 6、注意事项 （1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将比色槽暗箱盖打开，使光路切断，以延长电管使用寿命。 （2）手拿比色杯粗面，装液量一般占比色杯体积的2/3～3/4； （3）本型仪器A值在0.1～0.8之间误差较小，准确度较高。 实验一 双缩脲法测定蛋白质含量 一、实验目的 1、掌握双缩脲法测定蛋白质的原理及操作方法 2、了解血清总蛋白测定的临床意义 二、实验原理 什么是肽键？ 什么是双缩脲？ 三、实验步骤 四、注意事项 血清及标准液取量应准确（刻度吸管的使用注意事项）。 须于显色后30min内测定。 五、临床意义 正常成人血清总蛋白含量为：60-80g/L。 血清总蛋白增高： （1）血液浓缩，导致总蛋白浓度相对增高； （2）血浆蛋白质合成增加：主要见于球蛋白合成增加，如多发性骨髓瘤患者。 血清总蛋白降低： （1）血液稀释，导致总蛋白浓度相对降低； （2）消耗增加：如甲状腺功能亢进，恶性肿瘤等。 （3）蛋白质丢失：如肾病综合征病人大量蛋白从尿液中丢失。 六、思考题 蛋白质测定的方法有哪些？请简述其原理？ 实验二 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定——赖氏法 一、实验目的 1、掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本原理及方法。 2、了解血清丙氨酸氨基转移酶测定的临床意义。 ALT测定方法 速率法 手工法 赖氏法（30min） 金氏法（60min） 穆氏法（60min） 二、实验原理 四、实验结果 【参考范围】 5～25卡门氏单位。 五、注意事项 1、吸血清、标准液的量要准确。 2、充分混匀使反应充分。 3、酶促反应的时间要把控好。 4、严重脂血症、黄疸及溶血血清可增加测定的吸光度，应作血清标本对照管 六、临床意义 ALT广泛存在于一般组织细胞中,肝细胞中此酶含量最多。肝炎、中毒性肝细胞坏死等肝病时，血清中此酶活性增加。因此，测定血清ALT的活性对肝脏疾病的诊断有很大意义。 七、思考题 1、血清丙氨酸氨基转移酶的测定有何临床意义？ 2、血清丙氨酸氨基转移酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？ 丙氨酸 ?-酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸 1、转氨基作用 2、显色反应 ?=505nm 5.0 5.0 0.4mol/L NaOH溶液 混匀后，置37℃保温20min － 0.5 基质缓冲液 0.5 0.5 2,4二硝基苯肼溶液 混匀后，置37℃保温30min 0.5 － 基质缓冲液 0.1 0.1 血清 测定管 测定空白管 加入物(ml) 1、测定管及测定空白管的制备 三、实验步骤 5.0 5.0 0.4mol/LNaOH溶液 混匀，37℃水浴20min 0.5 0.5 2,4-二硝基苯肼溶液 0.45 0.50 基质缓冲液 0.05 0 2.0mmol/L丙酮酸标准液 0.1 0.1 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 标准管 试剂空 白管 加入物(ml) 2、标准管及试剂空白管的制备 3、室温放置5min，在波长505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光度。 测定管吸光度?测定空白管吸光度 标准管吸光度?试剂空白管吸光度 = ? 28 （卡门氏单位） 酶活力计算：不做标准曲线时，可以做28卡门氏单位的标准管，按下式计算： * * 生物化学实验技术 生物技术专业实验室 王小英 1、掌握刻度吸量管及分光光度计的使用方法。 2、掌握分光光度法测定物质含量的方法。 3、熟悉实验室规则，实验报告的书写要求。 4、了解分光光度法的基本原理和溶液的混匀方