动植物检疫毕业论文-基于Candidatus Liberobacter asiaticum β-operon的PCR检测技术研究.docVIP

基于Candidatus Liberobacter asiaticum β-operon的PCR检测技术研究 PCR Detection of Citrus Huanglongbing Bacterium Based on the β-operon  目录 摘 要 II 关键词 II Abstract II Keywords II 1.前言 1 2.材料和方法 1 2.1 植物材料 1 2.2 引物来源 1 2.3 方法 2 2.3.1总核酸的提取 2 2.3.2核酸的检测和凝胶电泳分析 2 2.3.3 PCR的扩增和凝胶电泳分析 2 3 结果和分析 2 3.1不同材料抽提的总DNA的浓度、纯度和完整性 2 3.2 PCR扩增产物的电泳分析 4 4.讨论 6 参考文献 7 致谢 9 附录实验试剂 10 摘 要 以基于柑橘黄龙病病原亚洲菌系β-操纵子的特异引物fA2/rJ5进行PCR扩增，依据是否有目标DNA片段的产生来检测柑橘黄龙病菌的存在与否。该检测技术，具有快速、简便、灵敏等特点，可用于柑橘黄龙病的早期诊断，对控制该病害的传播具有重大意义。 关键词 柑橘黄龙病；β-operon；PCR；检测 Abstract Specific primer pairs fA2/rJ5 based on the β-operon of Candidatus Liberobacter asiaticum was used for PCR detection of citrus Huanglongbing bacterium, The result was depended on whether the target DNA fragment was existed. This PCR protocol is efficient, convenient and sensitive for early detection of citrus Huanglongbing bacterium, which was very important for the control of the spread of the disease. Keywords citrus Huanglongbing; β-operon; PCR;;detection  1.前言 柑橘黄龙病是柑橘上的一种侵染性病害，引起柑橘产量、品质下降，甚至导致整株橘树枯死，橘园毁灭，给世界柑橘的生产造成极大威胁。20世纪初，在我国的华南地区首先发现了黄龙病，以后在福建、广西、江西、浙江、湖南、四川、云南、海南和台湾相继发现。目前柑橘黄龙病在亚洲、非洲和美洲地区都有发生，存在三种菌系，即亚洲菌系（Candidatus liberobacter asiaticus）andidatus liberobacter africanus）andidatus liberobacter amercanus）。柑橘黄龙病菌是一种韧皮部杆菌（Liberobacter），其病原菌难以得到分离和提纯，主要是通过木虱、接穗和苗木等途径传播。柑橘黄龙病表现的典型症状有3种，即黄化型、系统斑驳型和缺素型，使叶片变黄，影响果实发育，使柑橘产量降低，品质下降，病情严重时使根系腐烂，影响地上植株的生长，最终导致橘树死亡。近年来随着柑橘产业的发展，柑橘苗木调用混乱导致该病发生面积有逐年扩大的趋势；同时由于全球气候变暖影响，传病虫媒越冬范围扩大，也使得该病害的发病范围不断扩大。控制本病害的传播主要有三种措施：一.实行严格检疫，防止带病接穗和苗木的传播。二.建立无病苗木基地，选种无病苗木。三.铲除病株，防治虫媒介体。这些防治方法的有效实施，需要一套快速、灵敏、准确的检测技术相配合。而以往的一些检测方法，灵敏度不高，在一些未显症状的病株体内病原物极低，不能检测出这样低的浓度，只有寻找新的检测技术。通过PCR扩增技术，可以将微量的目标DNA片段进行特异性扩增、放大，既可以检测植株是否感染病原，又能获取大量的纯病原DNA，有利于柑橘黄龙病原的分子生物学研究，这也为防治柑橘黄龙病提供了理论和事实依据。 2.材料和方法 2.1 植物材料 纽荷尔脐橙（Citrus.sinensis）））），，，，）.3.2核酸的检测和凝胶电泳分析 取1ulDNA溶解液，加入69ulddH2O稀释70倍，用核酸蛋白质检测仪(Amersham sciences,ULTROSTES 2100 PRO)分析总核酸的浓度和纯度； 1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。 2.3.3 PCR的扩增和凝胶电泳分析 PCR反应体系包括：10×PCR反应缓冲液2.5μL，同源引物和互补引物各1μL，10mMoldNTPs0.5μL，模板DNA1μL，TaqD