第2章 工具酶.pptVIP

注意衔接体经过去磷酸化处理 HphI 一种IIs酶 * 这种方法对序列有一定要求：例如在12个核苷酸序列中没有G/C或A/T (T4连接酶处理同源区的两条链时，切掉的序列是互补的，这样留下来的序列也刚好互补，形成粘末端） 和T4连接酶一起加入了dGTP * 没有和T4连接酶一起加入了dGTP，这样必须控制合适的反应时间（半小时），然后加入某种脱氧核苷酸终止反应。 这种方法对连接点的序列没有要求。 * 其它特异性的限制酶 Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子编码，用于rRNA的剪切 5’-TAGGGATAA↓CAGGGTAAT-3’ ↑TATT I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子 5’- CTCTCTTAA↓GGTAGC -3’ ↑AATT 第二节 DNA 连接酶及连接方法  2.1 DNA连接酶连接DNA分子的机理 2.2 体外连接DNA的反应条件 2.3 连接方法 2.4 无需连接酶的连接方法 研究者发现细胞中线状的DNA分子经常能够自动环化起来，形成稳定的环状结构。而在体外，线状的DNA分子虽然也能够自动环化起来，如果没有任何其它酶的作用，这种结构很不稳定，容易在加热后重新解开成线状，由此推测细胞内存在一种连接DNA分子的酶。 1967年，世界上有3个实验室几乎同时在大肠杆菌中发现了一种能够催化两条DNA的末端之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。 第二节 DNA 连接酶及连接方法 ★ 2.1 DNA连接酶连接DNA分子的机理 被连接的两个DNA末端，3′-末端有一个游离的羟基（3‘-OH），5’-末端有一个游离的磷酸基（5‘-P）； 游离的3’-OH和5‘-P彼此相邻，并且各自位于已经配对的核苷酸的末端（T4连接酶除外， 3’-OH和5‘-P可以游离） 需要能量,Mg2+ 只能连接粘性末端 不但能连接粘末端，还能连接平末端。 ★ 形成酶－AMP复合物 DNA腺苷化 形成磷酸二酯键 其他连接酶T4 RNA连接酶 (1)连接反应的温度 37?C。 酶最适温度： 在37℃下粘性末端的结合很不稳定,一般采用 4～16 ?C；平末端连接可用较高温度 反应温度： 2.2体外连接DNA的反应条件 (2)连接物浓度 线性片段的自环化： DNA浓度较低，以增加两末端连接几率 载体与克隆片段连接： DNA浓度较高，一般20nmol/L以增加不同DNA分子连接几率；克隆片段浓度远大于载体，比例在2-6之间较好 平末端片段连接： DNA浓度较高 (3)酶浓度 粘末端酶用量较少，0.1Weiss单位；连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍 ★ Weiss 单位：37℃?20min内将1nmol的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上所需的酶量。 2.3 连接方法 (1) 载体去磷酸化 减少载体自连的几率，提高克隆效率 ★ (2) 连接体与衔接体 外源片段内部不能含有连接体中的连接位点 外源片段无需酶切处理，内部可含有连接位点 dTTP (3) 同聚物加尾 核酸外切酶从5‘端切除数个核苷酸 在突出的3’端用末端转移酶加尾 粘末端互补后用DNA聚合酶补齐单链间断区 连接酶连接切口 AAAAAAAAA TTTT 缺口 (4) T载体连接 Taq酶扩增的PCR产物一般在3‘端有一个突出的A 将载体用HphI处理后产生3’端突出的T 粘末端配对连接 (5) 末端补平/削平 T4或Klenow DNA 聚合酶具有5‘－3’DNA 合成能力，可补平5‘端突出双链DNA；同时具有3’－5‘DNA 外切能力，可削平3‘端突出双链DNA 补平后平末端连接 (6) PCR引入酶切位点 …AGGCTACCTAGT GCCTTAAGCTAT… （7）无需连接酶的DNA连接方法 Ligation-independent cloning (LIC) PCR products and a PCR-amplified plasmid vector 粘末端互补达10bp 转化E.coli,无需连接酶 ☆ Treat both the vector and the insert with T4 DNA polymerase in the absence of dNTPs to generate overhangs stopped the reactions by adding 1/10 volume of 10 mMdCTP Sequence and Ligation-ind