DNA甲基化检测专题枫树海树枝讲述.pptx

——MSP vs. BSP ;;DNA甲基化基本概念; DNA甲基化是唯一发生在哺乳动物细胞内DNA合成后的修饰作用，是调节基因表达的机理之一。 DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导基因的重新活化和表达。 DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。 结构基因中广泛存在着相邻的两个CG，其中胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化且两个甲基基团在DNA双链大沟中呈特定三维结构（CpG）。 CpG序列在哺乳动物基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。;CpG岛（CpG Island）;DNA甲基化生物学作用;2. DNA甲基化与肿瘤; 继人类基因组计划结束后，2003年人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium, HEC)宣布开始投资和实施人类表观基因组计划(HEP)。; 随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。甲基化检测方法分为两类，甲基化分型(methylation typing ) 甲基化图谱( methylation profiling)，后者又被称为甲基化组学( methylome)。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。; 根据研究所用处理方法不同，即DNA的甲基化修饰（指CpG二核昔酸中胞嘧啶的5 位碳原子加上一个甲基基团，形成5 甲基胞嘧啶）。一般而言，可以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种： 由于受到仪器等条件的制约，应用比较广泛的是前三种方法。 ;DNA甲基化PCR特点;?结合重亚硫酸盐的测序法 （Bisulfite Genomic Sequence, BSP）;DNA甲基化PCR影响因素;1. 引物因素;2. 反应体系因素;3. 反应温度因素; 亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0-3.9 mol/L。 修饰时间控制在10-16h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化为尿嘧啶且DNA模板破坏加剧；时间过短会导致修饰不彻底。从而可能出现PCR只能扩出U，M出不来。 反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)； DNA模板量应控制在=2 ug为宜，以保证修饰完全。 ;引物设计 ——获取启动子区域序列 1）/ ; 引物设计 ——设计引物 1） ; 提取DNA DNA甲基化 检测与测序分析 ; Thanks ！