噬菌体展示技术和其通用实验技术简介资料.pptxVIP

噬菌体展示技术及其通用实验技术简介;噬菌体展示 Phage display ;1.什么是噬菌体展示技术？;1.1噬菌体展示技术的发展;1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽 Smith GP. Science.1985; 228:1315-7 1988 噬菌质粒系统 1990 抗体片段的展示 1993 展示cDNA文库 1994/1995 研发了‘phage two-hybrid’技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of phage display with high-density arrays 2001 Automated phage display selection;2.噬菌体展示技术的原理; 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。;3.常用的噬菌体展示系统;3.1 噬菌体结构;3.2 噬菌体的分类;按照噬菌体的核酸类型分类可分为：ss RNA：噬菌体中所含的核酸是单链RNA。ds RNA：噬菌体中所含的核酸是双链RNA。ss DNA：噬菌体中所含的核酸是单链DNA。ds DNA：噬菌体中所含的核酸是双链DNA。;3.3 噬菌体侵染细菌;3.3 噬菌体侵染大肠杆菌; 3.4 λ噬菌体展示系统;3.5 T4噬菌体展示系统;3.6 单链丝状噬菌体展示系统;M13噬菌体遗传图谱和结构示意图; ; PⅢ展示系统，PⅢ有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。; 3.6.3主要衣壳蛋白PⅧ展示系统;3.6.4 噬菌粒载体和辅助噬菌体;相比噬菌体载体噬菌粒具有以下优点： 1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征； 2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤； 3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。;pCANTAB5e噬菌体质粒图谱; 辅助噬菌体可以提供噬菌粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需的所有蛋白和酶。能够帮助噬菌体载体在大肠杆菌体内包装复制。比如M13KO7辅助噬菌体。 M13KO7辅助噬菌体是由M13噬菌体改造而来，在M13复制起点插入了卡那霉素抗性基因用于筛选。 能够在唔噬菌体质粒的情况下复制 当有噬菌体质粒时，由于噬菌体质粒含有野生型M13或者是f1复制起点，因此，单链噬菌体质粒的DNA 会被优先包装并分泌。 ;噬菌粒在辅助噬菌体的帮助下在大肠杆菌体内完成组装;4.单链丝状噬体展示在重组抗体制备中的应用;4.1单链丝状噬菌体展示在鼠源重组抗体制备中的应用; 噬菌体抗体文库的构建类型主要有三种：天然抗体文库，免疫文库，合成抗体文库。在残留分析领域最为实用的技术是免疫抗体文库。免疫抗体文库在免疫过程中经历了一个亲和突变的过程，因此从免疫抗体文库中筛选出来的抗体具有更高的亲和力和特异性。; 抗体（Ab）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。借助于基因工程技术，既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改造。其中小分子抗体因其分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统中表达及易于对其进行基因工程操作等优点而受到研究者的重视，并成为基因工程抗体的研究热点。常见的单价小分子抗体有 scFv、Fab、Fv 等。其中scFv小分子抗体具有抗体抗原识别的全部位点，而且分子量小，稳定，易于表达的优点被广泛的采用，现以scFv单链重组抗体为例做简述。;4.2 scFv单链重组抗体的制备;scFv重组基因的构建;scFv基因与噬菌体质粒pCANTAB5e连接; 重组后的噬菌体质粒转化进宿主细胞，并在辅助噬菌体的帮助下在宿主体内完成组装，复制，增值的过程。; 融合蛋白的表达是低价的，只有不到10％的噬菌体可以表达融合基因，其余噬菌体展示的均是野生型噬菌体的p3蛋白，所以想要获得亲和高特异性好的噬菌体文库需要进行多轮的淘筛来进行筛选