动物细胞的体外培养详解.ppt

从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 冻存和复苏最好用新配制的培养液； 在冻存时要均匀减少细胞内水分，减少冰晶形成。 细胞污染的种类和判定 细胞培养中常见的污染： 1、细菌污染 2、真菌污染 3、支原体污染 4、外源病毒污染 培养液颜色变黄，出现浑浊显微镜下观察有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周围有大量细菌细胞生长停止，并有中毒表现。 圆球状颗粒漂浮物 显微镜观察到的细菌污染 肉眼可见培养液中见白色或黄色漂浮物，倒置镜下可见丝状、管状、树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养皿中，有的形态呈卵形或链状排列，散在细胞周边和细胞之间生长，培养液多不浑浊 显微镜下观察到的真菌感染 黄色漂浮物 树枝状 链状 黄色漂浮物 培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化。  3T3-L1细胞，用hoechst33342染色 黑色的小点 1.细菌、真菌污染的检测 污染物的检测 1）肉眼观察：细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变浑浊，或略加振荡可观察到很多漂浮物。 漂浮物 2、镜下观察： a.在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。 b.若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。 酵母菌 Hela细胞 2、支原体污染的检测 a.荧光技术检测 利用荧光染料检测支原体污染。被支原体污染的细胞经染色后在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA，证明有支原体污染。 被污染 未被污染 纯水仪 CO2 培养箱 培养瓶 培养器皿 培养板 血清 一般常用为小牛血清(包括胎牛血清),人血清和其它动物血清。 二.培养基的组成成分 氨基酸（必需氨基酸） 谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。 维生素 维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。 碳水化合物 细胞生长的主要 能量来源其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 平衡盐溶液 主要用于稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压 ，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。 抗生素 常用为青霉素和链霉素、两性霉素，以抑制革兰氏阴性菌和阳性菌的污染。 氢离子缓冲器 成纤维细胞生长因子 表皮生长因子 FGF EGF 三.培养基的物理性质 PH 大多数细胞在PH =7.4时生长最好，一般6.8 --7.6。 温度 温度除直接影响细胞生长外，也与培养液的PH值有关。 如：低温时，CO2 溶解多，影响PH值。 PH指示剂 粘度 粘度对细胞生长影响较少，但在细胞培养或用胰蛋白酶处理时，为尽量减少细胞损伤 ，可通过提高培养液粘度来克服。加羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮 来增加粘度。 表面张力和泡沫 表面张力有利于培养物粘着于底物上面。在悬浮培养中，减少泡沫的产生，加防泡沫硅。 渗透压 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。 原代培养 传代培养 细胞的衰退 细胞培养的类型 一、细胞原代培养 从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 严格的说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养 ，随不同的组织时间长短不一，一般为1-4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂但不旺盛。 原代培养6天后的大鼠神经元 1.组织解离： 1）胰蛋白酶解离细胞法: 2）胶原酶解离细胞法 3）机械解离细胞法 2.细胞解离 无菌条件下采取动物组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液中，然后尽快在超净台内进行解离处理。 ｛ 解除了细胞之间的“组织关系”从而可以反映出单个细胞的生物形态 原代细胞培养的方法 ｛ （1）外植块细胞培养 （2）单层细胞培养 （3）悬浮细胞培养 (1)外植块培养：外植块在一定限度内可保持其原有组织结构，有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料来源之一。 在动物培养中，一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形成致密的细胞单层。 优点： ①更换新鲜培养液比较容易。一般1-3天换液一次，细胞长成单层后