改过分子生物学创新实解说.pptVIP

2013年度 分子生物学创新实验 人视黄醇结合蛋白的克隆、鉴定以及原核表达 指导教师：田生礼 【目的要求】： 分子生物学创新实验综合了：DNA的分离、纯化、克隆到目的基因的鉴定、表达等一系列的分子克隆基础实验，形成一个涵盖现代分子生物学基础实验内容的整体实验。通过对实验内容整体的了解，进一步巩固有关分子生物学的相关理论知识，并较系统地学习和掌握分子生物学的基本实验方法、技术和操作技能。 技术要求：理解并熟悉分子生物学实验技术（包括DNA技术、RNA技术、蛋白质技术、杂交技术等）的基本原理方法，掌握DNA提取纯化、定量、DNA克隆、电泳等基本实验技术，重点掌握质粒DNA纯化技术、酶切技术、DNA片段回收、重组连接技术、电泳技术、转化技术、基本PCR技术以及蛋白质的诱导表达技术等。 【总技术路线图】： 大肠杆菌BL-21感受态的制备 质粒pET-32a- hRBP 转化 菌液质粒提取、质粒酶切鉴定、质粒PCR鉴定 不同时间IPTG诱导目的蛋白表达(按时间梯度取样) 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白 得出结果，总结，上交实验报告 不同浓度IPTG诱导目的蛋白表达(按浓度梯度取样) 所用菌种与质粒： pET-32a-hRBP、大肠杆菌BL21（DE3）（基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3）） 【实验材料和用品】： 实验仪器： PCR仪、超净台、电泳槽、凝胶成像及分析系统、天平称量仪、超纯水仪、台式高速离心机、水浴锅等 实验主要试剂： DNA限制性内切酶BamH I、Xho I、DNA Marker和Taq DNA Polymerase、质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒及其他化学试剂。 1、取10ul BL21菌液于3mL LB培养基中,37℃摇床培养过夜 2、取500uL过夜培养物转接于3ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm） 3、将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作 4、吸取1ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟 5、4℃下4000rpm离心2分钟 6、弃去上清，加入100?l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻吹打均匀，使细胞重新悬浮，在冰放置30分钟 7、4℃下3000rpm离心2分钟 8、弃上清，加入100?l预冷0.1MCaCl2，轻轻吹打均匀，使细胞重新悬浮 9、细胞悬浮液可立即用于转化实验（推荐）或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。 一、感受态制备及转化 【具体实验步骤】： 转化 1、从-70℃冰箱中取100μl感受态细胞悬液，冰上解冻，解冻后置冰上。2、 加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过5μl)，轻轻摇匀，冰上放置20分钟后。 3、42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入800μl LB液体培养基 (不含Amp)，混匀后37℃低速振荡培养1小时，使细菌复苏。（表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )）。 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。 对照是拿未转化的细菌涂板。 二、质粒提取 1、配制LB液体培养基及抗生素（AMP） 2、挑取单克隆菌落接种至5ml LB培养液中（含AMP 50ug/ml） 37℃振荡培养过液 3、取1.5-3ml培养液至Eppendorf管中，12000r离心2min，弃上清 4、按照质粒小提试剂盒说明书上的步骤操作 5、提取完毕，进行下一步实验操作或-20℃保存 提取完的质粒，一部分用来PCR，一部分用来酶切。PCR用水做对照 酶切无对照。 三、目的基因hRBP PCR鉴定 组成成分 加入体积（μl ） 10×PCR Buffer 5 dNTP 4 引物1 0.5 引物2 0.5 模板（质粒） 1 Taq酶 0.5 无菌水 38.5 总体积 50? 温度 时间 循环数 94 ℃ 5 min 1 94 ℃ 30 sec 30 55 ℃ 30 sec 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10 min 1 四、载体与目的基因双酶切鉴定 取一个0.2ml的Eppendorf管，在其中加以下各种成分反应液，酶切体系如下表。 加样完成后混匀、离心，置于370C条件下反应3个小时。 酶切后取10ul进行凝胶电泳检测、拍照。 组成成分 加入量（μl ） 限制性内切酶Xho I