PCR技术及测序概述.ppt

PCR技术及原理 PCR反应原理 PCR技术是利用DNA在体外高温时破坏氢键，变性成单链，低温时引物与单链按碱基配对原则结合，再调温至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5′-3′）的方向合成互补链。即： PCR反应过程 荧光定量PCR 荧光定量PCR是在一般PCR扩增反应进行的同时加入特异性荧光探针（寡核苷酸）两段分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团，探针完整时荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，扩增时Taq聚合酶5′-3′外切酶活性将荧光基团酶切降解，使之分离，从而荧光监测系统收到荧光信号。每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与产物形成完全同步。 基因测序技术 1.第一代：Sanger链终止法、Gilbert化学降解法 2.第二代：454、Illumina、 SOLiD 3.第三代：Helico BioScience Pacific BioscienceSMRTT Oxford Nanopore Technologies Ion Torrent Sanger链终止法测序原理 由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP，ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。 Gilbert化学降解法测序原理 用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。该法设计四组特异的反应：①G反应，用硫酸二甲酯使鸟嘌呤上的N7甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，导致多核苷酸链可在该处断裂；②G+A反应，用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂；③T+C反应，用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基；④C反应，在有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。这样一来，同一个末端标记的DNA片段在四组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基，生成四组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点，每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离此后组产物，再从放射自显影片上即可读出序列。 454测序 1.文库制备：454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库 454测序 2.乳液PCR：将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。 454测序 3.焦磷酸测序：测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。　　测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化