2014根系活力测定(4种)分解.pptVIP

实验目的 植物根系是水分和矿质营养的主要吸收器官，也是多种物质（如氨基酸、植物激素、生物碱等）的同化、转化或合成的重要器官，因此，根系的生长发育状况和根系的活力强弱将直接影响植物的生命活动，根系活力是植物生长的重要生理指标之一。 试验测定方法的多样性、实用性与可靠性 如：TTC、Evans blue、??萘胺法、FDA、甲烯蓝法、PI等方法 实验原理 1. TTC法： 氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准的氧化还原色素，其氧化态无色并溶于水，还原态则是不溶于水的三苯基甲腙（TTF）红色物质，它在空气中不会自动氧化、相当稳定。根系细胞中脱氢酶（如琥珀酸脱氢酶）（或活细胞的NADH，NADPH）可作为TTC的氢供体，从而将TTC还原为TTF。外加琥珀酸可增强TTC的还原。 3、??萘胺法： 吸附在根表面的??萘胺会被植物根氧化，生成红色的2-羟基-1-萘胺而沉淀于有氧化力的根表面，据认为该反应是在过氧化物酶的催化下进行的，该酶的活力愈强，对??萘胺的氧化力也愈强，根染色也愈深。故可根据根表面染色的深浅，定性判断根的活力。 定量测定是根据??萘胺与根系接触一定时间后??萘胺量的减少量来确定。在酸性环境中??萘胺与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐生成红色的偶氮染料，可供比色测定，其反应如下： 对氨基苯磺酸+ 2H+ +NO2- + ??萘胺 → 对-苯磺酸-偶氮-??萘胺 3. FDA方法※ FDA ：二乙酸荧光素（Fluoresencein diacetate，母液为5 mg/mL的FDA DMSO溶液，储存在0℃） FDA是一种非极性酯类物质，可以通过质膜进入细胞质，在细胞内酯酶的作用下水解脱去酯基团后在490-500 nm激发光下产生绿色荧光。 FDA （2μg/mL）被普遍用于细胞活力的测定 活力低的细胞具有较低的酯酶活性，因此绿色荧光较弱 死细胞因为不具有酯酶活性所以不会发出绿色荧光。 Reference: Ishikawa S and Wagatsuma. 1998. Plasma membrane permeability of root-tip cells following temporary exposure to Al ions is a rapid measure of Al tolerance among plant. Plant Cell Physiol, 39(5):516-525 不同浓度Al处理后三个品种小麦根尖细胞活力的变化 A：扬麦9号； B：Scout 66； C：Atlas 66； μmol/L 根尖质膜完整性测定：通过不透膜的分子荧光探针碘化丙啶（Propidium iodide, PI）来完成。 PI能够与核苷酸相结合，通过用来标记失去膜完整性的细胞（De cnodder等，2005），活细胞不被标记。 将处理好的植物根尖样品放进3μg/ml的PI溶液之中，10min后取出冲净，立即置于荧光显微镜下，在546 nm波长激发紫外光下观察、拍照。 Reference: De Cnodder et al., 2005. Regulation of cell length in the Arabidopsis thaliana root by the ethylene precursor 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid: a matter of apoplastic reactions. New Phytol, 168: 541–550 实验步骤 将幼苗分为两组: 一组为对照（处理A ）；另外一组根系浸没于沸水浴 20 min（处理B）。A、B两组处理结束后分别剪取根尖段（一般2cm），用吸水纸吸干表面水分，备用（估称一下重量） 注意：地上部需保留，作为下一次实验的材料 1. TTC法：A(Control)、B(Treatment, 热伤害)两组分别称取0.30 g根放入15 mL刻度试管（带盖的塑料离心管），在试管中加入10mL反应液（0.4%TTC溶液和0.067mol/L磷酸缓冲液的等量混合液，pH6.8） ，（盖盖）混匀，在37oC水浴中反应1 h（水浴浸没反应体系液面）。随后加入0.5 mL 2 M H2SO4中止反应（混匀），2min 后排干试管中的溶液，并用水冲洗2次（防止根丢失、冲掉）。 在试管中加入95%乙醇至5 mL刻度线 ，沸水水浴抽提10 min，冷却后用95%乙醇定容至5mL刻度线 （如果颜色深可以增加体积，以便比色，两个处理定容体积一致），溶液混匀后，在530 nm处测定吸光值（水为空白比色）。根据OD值计算根系相对活力（B÷A) ×100%。 2. Evans blue ： A、B两组分别0.3 g根尖段放入15ml试管