mRNA差别显示技术分解.ppt

研究激素对植物发育的影响 在植物的发育过程中，激素自始至终起着作用，调控着植物的器官形成、生长发育。研究其作用具有重要意义。Peters等发现，用玉米素处理红叶藜的细胞时，mRNA表达量迅速增加，从而使细胞分裂加快。Chen等发现，用赤霉素处理水稻幼苗，然后采用mRNA差异显示技术，处理过的幼苗中mRNA有特异的差异带(UBCgene)。克隆此片段，发现此片段影响基因调控过程中的某些蛋白。瞬时表达分析表明，该序列位于启动子转录起始位点上游231～159碱基位置；另外，还发现UBC gene可促进α-淀粉酶基因表达，从而调节水稻幼苗发育。 研究抗病机制 植物病害每年都使农作物受到大量损失，因此提高农作物的抗病能力不仅有利于减少损失，而且有利于减少农药使用和环境污染。目前研究植物抗病机理主要方法是探讨植物－微生物的相互作用机制。Benito等［18］通过研究西红柿真菌病害，利用差异显示法对抗病机理进行了探索。他们发现，健康的番茄叶和被真菌或烟草枯斑病毒侵染的番茄叶的mRNA有较大差异。在病菌侵入后，植物防卫基因会迅速产生一系列mRNA，产生蛋白与病原菌相互作用，杀死病原菌或病毒。在相互作用过程中，有3个mRNA片段(ddB-2，ddB-5，ddB-47)大量积累，但相互作用后，则很快消失。这表明，植物的抗病与某些防卫基因的瞬时表达有密切关系。 mRNA差别显示技术 生工1班 杨金鑫 主要内容 概述 定义及原理 应用及优缺点 展望 高等生物大约有3~5 万个不同的基因，在每一个正常的体细胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有10%~20%的少部分基因被选择性表达，这种选择性表达是在发育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命活动过程的核心机制。因此，比较不同组织之间，或相同组织在不同生理条件下，或胚胎在不同的发育阶段的基因表达差异，可分离并克隆出这些特异性表达的基因。近年来，该领域的研究取得了很大进展， 扣除杂交（subtractive hybridization, SH）、基因芯片技术（DNA chip technique）、基因表达的系统分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、噬菌体全套抗体库技术(phage display antibody repertoire library technique)和双向电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis)先后成功地建立。 一. 概述 基因表达调控的一种方式。指在对信号或诱导物做出应答时，选择表达不同的基因，或使基因的表达水平有所不同。 基因差异表达 DD的发明及其基础 由Liang于1992年创立 是分离差异表达基因强有力的工具 在随后几年里， Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 1）RT-PCR技术 2）以特定引物进行的PCR技术 3）DNA电泳技术 二.基本概念 mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。 反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 反转录PCR RNA指纹 RNA 首先在逆转录酶的作用下使RNA 逆转录为DNA，之后以其DNA 为模板，通过以DNA指纹技术建立指纹图谱进行分析。 DNA指纹 某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度