Chapter4离子交换和体积排除色谱1课程.ppt

液相色谱基础 离子交换与体积排除色谱 吸附/分配色谱 离子交换色谱（IEC） 原理 保留的影响因素 例子 体积排除色谱（SEC） 原理 校正曲线 凝胶过滤与凝胶渗透 影响保留的因素 例子 离子交换色谱的机制 离子交换平衡 离子交换的类型 硅胶型的离子交换剂 优点 高柱效 小颗粒 没有收缩或膨胀 机械稳定性好 能耐受有机溶剂 价格低 缺点 2 pH 7 低容量（meg/g） 聚合物基础上的离子交换 离子交换树脂的合成 聚合物基质的离子交换 优点 1 pH 12 高容量（meq/g） 缺点 机械稳定性不好 会收缩或膨胀 机械稳定性不好 能耐受的有机溶剂的量是有限的 离子交换能力 指交换剂结合离子的能力 通常填料meq/g来装填 若不考虑填充密度，可引起误解（can be misleading） 聚合物型：5meq/g,密度 0.2g/ml →1meq/ml 硅胶型： 1.5meq/g,密度 0.5g/ml →0.75meq/ml 容量越大，需要越强的流动相洗脱强度 对弱离子交换，取决于流动相的pH值 交换能力与pH值的关系 在离子交换色谱中影响保留的因素 流动相的离子强度（k） pH (k, α) 抗衡离子的浓度(k, α) 温度(k, α) 影响平衡 共存离子(α) 有机溶剂(k, α) 克服反相的影响/与疏水基团的相互作用色谱柱类型，强或弱离子交换剂 离子强度的影响 pH 值的影响 不同离子的洗脱强度 阳离子交换剂 Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg2+Mn2+Ag2+Cs2+Rb2+K+NH4+Na+H+Li+ Li是最弱的 阴离子交换剂 柠檬酸盐3-SO22-草酸盐2-I-NO3-CrO4-Br-SCN-Cl-]醋酸盐-OH-F- 氟化物是最弱的 温度的影响 流动相：1M KH2PO4，pH 3.8 柱温：60℃ 流速：4ml/min 色谱柱：Silica SCX IEC－应用 氨基酸 典型的应用，由Moore 和Stein在上世纪50年代末发展而来 蛋白质 无机离子 也称离子色谱 氨基酸的离子化 用IEC分离氨基酸 用IEC分离蛋白质 可应用于多有的蛋白质 对生物活性有非常好的重现性 对电荷差别特别小的蛋白质分离能力非常强 对浓度小体积大的样品分离能力很好 是可分离的质量数最高 可有多种途径改善分离效果 选择离子交换剂类型的原则 用于蛋白质分离的离子色谱 填料粒径：5-40μm 色谱柱内径：5-50mm 长度 5-30cm 选择合适的pH值 蛋白质表面电荷 问题：你认为这三种蛋白质哪一种会最后一个被洗脱出来？ pH值对蛋白质分离的影响 色谱柱：Protein –Pak DEAE 8HR 10×100mm（阴离子交换） 流速：1.5ml/min 梯度：0-200mM NaCl 缓冲盐：20mM TRIS-HCl C=Conalbumin （伴清蛋白） T=Transferrin （铁传递蛋白） O=Ovalbumin （卵清蛋白） S=Soybean trypin inhibitor（大豆胰岛素抑制剂） pH梯度 蛋白质的分离－反离子的影响 色谱柱：Protein –Pak DEAE 8HR 10×100mm(阴离子交换) 流速：1.5ml/min 缓冲盐：20mM TRIS-HCl pH 7.5 梯度：0-200mM NaCl 0-200mM NaAcetate C=Conalbumin （伴清蛋白） T=Transferrin（铁传递蛋白） O=Ovalbumin （卵清蛋白） S=Soybean trypin inhibitor（大豆胰岛素抑制剂） 蛋白分离的共离子效应 IEC分离无机阴离子 色谱柱：Water IC-Pak A HR 洗脱：硼酸盐/葡(萄)糖酸盐 流速：1.0ml/min 检测器：电导检测器 IEC分离无机阳离子 体积排阻色谱 SEC的机理 待测无经过一个多孔凝胶固定相 凝胶孔径可能是一种也可能是几种的混合，取决于所选用的柱子 分离取决于在溶液中的大小而不是分子量 体积排阻色谱中保留体积与分子量的关系 SEC定义 凝胶过滤（GFC） 此名词原用于描述生物聚合物SEC，现在也指水相SEC。蛋白，多糖等，洗脱液常为水相。 凝胶渗透（GPC） 此名词原用于描述有机聚合物SEC，现在也指有机相SEC。聚乙烯，聚丙烯等，洗脱液常为有机相，如THF或甲苯。常采用高温90－140℃（高温GPC） 硅基团水相SEC柱 聚合物型水相SEC柱 交联环氧丙氧基甲基丙烯酸酯 表面含有醇或二醇官能团 亲水性，阻止与极性化合物的反应 表面通常有负