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第四章DNA序列分析（DNA Sequencing) 罗建新 一．概述 二十世纪 六十年代 Sanger Brownlee创立了RNA序列测定技术 1975年 Sanger创立DNA测序方法 加减法 1977年Maxam Gilbert创立 化学降解法 80－90年代 DNA芯片技术 荧光DNA分析技术 毛细管电泳技术 DNA测序仪 二.DNA序列测定方法 加减法 末端终止法 化学降解法 毛细管电泳技术 DNA测序仪 Pyrosequencing (一)末端终止法 主要步骤 1.ssDNA模板制备 2.与测序引物退火 3.标记反应 4.引物延伸,终止反应 5.PAGE 6.Autoradiograph 7.阅读分析结果 (二) DNA 测序仪 原理 沿用Ｓａｎｇｅｒ等建立的双脱氧链末端终止法,ＤＮＡ聚合酶催化延伸反应产生的ＤＮＡ片段仍需通过序列胶电泳分离,标记为无放射性伤害的荧光标记物。荧光标记物共有4种,掺入方式有两种:一种是标记引物(5′一端标记),另一种标记ｄｄＮＴＰ(3′一端标记),反应完成后采用四标记单泳道电泳法分离ＤＮＡ,一次可读出的ＤＮＡ长度为400—500ｂｐ 九十年代,欧洲分子生物学实验室(ＥＭＢＩ)与瑞典ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ公司也联手推出了新型的全自动激光序列分析仪,完成了ＤＮＡ序列测定的又一次重大突破 原理:Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧法,但标记物只有一种 标记方式有两种 标记引物(5′一端标记) 标记底物(荧光素标记的核苷酸) 采用单荧光标记四泳道分别加样的方法,可提高测序结果的准确性,每克隆可测1000ｂｐ,两条ＤＮＡ模板分别测序后精确率99.7% 举例: PE-377型全自动分析仪 特点： 1．四色荧光标记，一个泳道测序的方法，避免单一标记（如：同位素标记）四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，同时一个样品只占用一个泳道，使一次测定样品数目大大增加（至96个），因而具有精确度高，一次测定样品数多 ２．测序能力强 荧光检测器采用激光激发、CCD摄像机同步成像技术，代表不同碱基信息的不同颜色荧光先经光栅分光，再经CCD摄像机成像，具有一次扫描可检测多种荧光的特点，测序速度高达200bp/小时，此外一个样品一次可测定800-1200个碱基，而同位素测序一次只能测定200－300个碱基 ３． 电脑单点控制 包括电泳参数设置，数据收集和分析以及结果输出 电脑可在电泳过程中对仪器运行状态进行同步监测，电泳结果也可以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出 ４．电泳的精确控温 采用上下缓冲液环泵和温度检测器，使电泳温度恒定在51℃，这样可提高测序精度，调节温度，还可进行特殊应用研究，如：SSCP 采用恒定电压，而非恒定功率，可减少迁移率的变化，进一步提高电泳结果的重复性。 ５．测序方法灵活多样 采用两种荧光染料标记方法（标记终止物ddNTP法和标记引物5’端法），两种DNA聚合酶（Sequenase和AmpliTaq），提供20钟测序试剂盒，可满足各种DNA模板（单链DNA，双链DNA，PCR产物）和测序策略的要求 ６ 多功能 提供三种不同长度的凝胶电泳板，可根据对电泳时间和样品分辨率的不同要求选择，进行DNA序列分析，DNA片段大小分析（碱基分辨率可达1bp）和DNA片段定量分析（可检测从单一分子扩增的产物） (三) Pyrosequencing 焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便 特点 不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素 可满足高通量分析的要求（如：瑞典Pyrosequencing AB公司PSQ 96系统 10分钟内可分析96个样品的SNP） 每个样品孔都可进行独立的测序或SNP分析，实验设计灵活。 序列分析简单，结果准确可靠 Pyrosequecing的原理 由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应.在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。 分析步骤 第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymera