3.酶化学解说.ppt

第六节 酶的分离纯化及其活性测定 注意事项 尽量减少酶活性的损失；低温 0～5℃，有机溶剂：-15～-20℃；抽提液加入EDTA（络合金属）；抽提液加入巯基乙醇（防止-SH氧化，使酶失活）；不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性；测定酶的比活力，使比活力升高。酶易失活，不可烘干。通常先透析出去小分子，浓缩，结晶或冷冻干燥制成干粉保存于冰箱。如果是酶液，与等体积甘油混合，并适当加入竞争性抑制剂-20℃长期保存。 分离纯化 活性测定 目的 过程与方法 注意事项 1 2 (1) (2) (3) 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 酶活力： 指酶催化化学反应的能力。其衡量标准是酶促反应的速度。 所以酶活力测定就是酶促反应速度的测定 酶促反应的速度：在适宜条件下，单位时间内底物的消耗或产物的生成量。 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 1 2 (1) (2) (3) (4) (5) 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 酶促反应初速度 酶促反应速度在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。 其原因可能是： 底物浓度下降 ；酶在一定pH及温度下失活；产物对酶的抑制，产物上升而加速逆反应；反应体系中理化性质（pH、离子强度）的改变，会影响酶与底物的亲和性，以及辅助因子的可利用性等。因此，以酶促反应初速度表示酶活力。 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 产物浓度变化曲线 反应初速度 Vo 1 2 (1) (2) (3) (4) (5) 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 测定方法 测定酶活力就是测定一定时间底物的消耗量或产物的生成量，主要根据底物和产物的物理化学性质来选择具体的测定方法。通常是测定产物的生成量。 常用的方法主要有：比色法，分光光度法，化学滴定法，电化学分析法，比旋光度，荧光测定，放射同位素法，气体压测定，比浊法等。 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 1 2 (1) (2) (3) (4) (5) 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 活力单位 1976年国际生化学会（IUB）酶学委员会规定： 在特定的条件下（温度为25℃，其他条件为最适），每分钟催化1?mol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位（IU）。 1979年规定： 在特定的条件下，每钞钟使1mol底物转化为产物所需的酶量为1催量（kat）。 1 IU=16.67×10-9kat 单位质量酶产品中酶活力称比活力。 u/mg酶蛋白 u/ml酶蛋白 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 1 2 (1) (2) (3) (4) (5) 第六节 酶的分离纯化及其活性测定 实例 首先 确定反应条件 20℃、pH=7，底物浓度 6g/l（过量），加入2mg固体脂肪酶 第二 确定活力单位 如每小时催化1克底物 1u= 1g/h 第三 测算反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线，量出反应初速度值 ，换算为脂肪的消耗速度 如 8g/h 第四 换算活力 8g/h / 1g/h=8u 第五 计算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白 活性测定 分离纯化 酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位 实例 脂肪 脂肪酶 甘油 + 脂肪酸 1 2 (1) (2) (3) (4) (5) 第七节 酶的应用 酶工程的定义 ——是利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术，也就是利用酶或者微生物细胞、动物细胞、细胞器的特定功能，借助于工程学手段来为我们提供产品的一门学科。 酶工程的发展经历了如下过程：自然酶的开发和利用→固定化酶和固定化细胞→多酶反应器→仿生技术，包括化学酶工程和生物酶工程两方面。 酶工程 酶与牧医 酶的应用 概述 化学酶工程 生物酶工程 2 3 1 (1) (2) (3) 第七节 酶的应用 化学酶工程 亦称初级酶工程，主要由酶学与化学工程技术相互结合而形成 改善酶的性质以及提高催化效率及降低成本，包括化学修饰、固定化处理、 化学合成法 。主要研究和应用自然酶、化学修饰酶、固定化酶 、化学人工酶等。 人工酶是指模拟酶的生物催化功能，用化学半合成法或化学全合成法合成的酶称人工酶 固定化酶指被结合到特定的支持物上并能发挥作用的一类酶。是化学酶工程中具有强大生命力的主干。 酶的固定化有四种方法 ：吸附；交联 ；共价结合；包埋 优点： （1）可以用离心法或过滤法很容