第二十五章药物生物转化浅析.ppt

羟化反应 孕酮 皮质激素 环氧化反应 A环芳构化 脱氢 甾体生物转化的原理和方法 甾体生物转化的原理不同于氨基酸，抗生素，蛋白质等的发酵。而是利用微生物中特殊的酶对甾体的某一部位进行特定的化学反应获得的产物。在这一过程中为获得较多的转化酶，我们需要确保菌体产酶的最佳条件，诱导所需要的酶，抑制不需要的酶。 在菌体生长期结束后加入甾体底物，由于其不溶于但能溶于可与水按一定比例混溶的有机溶剂，再加入培养液中转化。 根据转化时微生物的状态可分为4种转化方式： 生长培养方式：在微生物培养的中后期加入底物，一边培养，一遍转化。 静态菌体悬浮方式：菌体充分生长后，离心得到的菌体悬浮在水或适当 的缓冲液中，再加入甾体进行转化。 混合培养方式：以A出发转化成B，需要两种以上的酶参与，单独转化费 时费力，所以常采用混合培养的方法，可以一步得到B 省略了中间过滤步骤。 固定化方式：一次制成的菌液反复用于转化是可行的，为了避免溶菌， 需要将其固定在水不溶载体上进行转化。 影响甾体生物转化的因素 物理因素 搅拌：增加搅拌速度，可以增加溶氧使基质均匀，提高转化率。 通气：增加氧的溶解，促进菌体生长及生物转化。 培养基的组成 碳源：常用的有葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，糊精。 氮源：（有机，无机 金属离子：增加对转化有益的离子，去除负向影响的离子。 产物的分析与分离方法 纯化 需要用适当的与水不溶的有机溶剂将甾体从转化液种提取出来。 常用的有氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷等。溶剂的用量需根据产物在转化液于提取液中的分配系数而定。提取时防止乳化。浓缩后利用各种色谱法得到较纯的甾体转化物。 分析 转化过程中需要实时监测残余底物及生成产物的量及比例，以确定转化终点。常用紫外分光光度法，HPLC等。 第四节 新技术在微生物转化的中应用 随着现代生物科学和生物技术的迅速发展，以及一些分析测试技术的应用，微生物转化也得到了进一步的发展。 基因工程技术、固定化细胞转化技术、双水相转化技术、超声波技术、有机介质微生物转化以及生物反应器等综合应用于微生物转化反应体系，不仅可使转化的效率成倍增长，而且还有可能使整个反应过程连续、自动化。 同时，一些分析测试技术如核磁共振、质谱等已经应用于微生物转化的在线检测。 一、基因工程技术在微生物转化中的应用 随着近年来分子生物学的发展，人们对基因工程的认识也逐步加深，这为微生物转化提供了新的思路。 基因工程技术的发展和实用化为此开辟了有效途径。只要生物细胞中存在有催化某一生化反应的酶，即使其量微不足道，应用基因重组技术，通过基因扩增与增强表达，人们就可能建立高效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞，从而进一步构建成新一代的催化剂——固定化工程菌或固定化工程细胞。 如，应用DNA重组技术建立了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌，这种工程菌组装的生物反应器可以用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸，反应液含丝氨酸超过400g／L，再从丝氨酸与吲哚转化生成色氨酸，反应液中色氨酸浓度达到200g／L。 此外．利用基因工程还可以将能进行生物转化的相关酶从微生物、植物甚至动物细胞中克隆出来．再导入一个微生物中进行表达，从而产生能对底物进行转化的一系列酶，将原来复杂的几种转化过程缩短为一个转化反应。目前在这方面的研究也是微生物转化的一个趋势，并且具有广阔前景。 二、固定化细胞转化技术在微生物转化中的应用 固定化细胞转化技术自20世纪70年代问世以来．已经广泛应用于工业、农业、医学、环境保护、能源开发以及理论研究等方面，并取得了丰硕成果。 利用固定化细胞转化技术，省去了破碎细胞提取胞内酶的过程，完整细胞得到固定后，酶活损失较少，活性回收率高，并且保持了细胞内原有的多酶体系，对于一些需要多步催化的反应过程，一步即可完成。 被固定的微生物细胞可以是处于生长状态或体眠状态的活细胞也可以是死亡的细胞(但胞内酶的活力仍 存在) 在微生物转化过程研究最多的是固定化活细胞包埋技术。常用的包埋材料有聚丙烯酰胺(PAA)、聚氨基甲酸乙酯(PU)、海藻酸盐凝胶、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝胶、聚乙烯醇(PVA)等。 以海藻酸钙凝胶为例，其制备过程如下：在室温条件下，将一定浓度的海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀后，滴加到氧化钙溶液中，形成球珠。 Kaul等采用了海藻酸盐固定化生物催化剂(简单节杆菌)和底物(氧化可的松)进行碳一位和二位脱氢反应研究。 每个凝胶珠都可以看成是