第十章流式细胞术及其应用--王平-2012讲课.pptVIP

细胞与免疫学研究技术及原理第七章：分析细胞学技术2012.12.13教学内容教学要求：掌握流式细胞分析技术、显微分析术以及激光共聚焦显微镜的基本原理，了解相关技术在细胞生物学技术及免疫学中的用途，了解相关技术的操作流程。教学内容：第一节：流式细胞分析术和分选术一、流式细胞分析术的原理二、流式细胞分析术的应用第二节：激光扫描共聚焦显微镜一、激光扫描共聚焦显微镜的原理二、激光扫描共聚焦显微镜的应用三、其他高分辨率显微镜四、显微成像技术的发展 流式细胞术及其应用流式细胞术（FlowCytometry,FCM）：是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞术的发展史流式细胞术的原理介绍流式细胞术在科研中的应用Overview流式细胞术发展简史流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。流式细胞术发展简史1934年，Moldavan首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数。在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland–Taylor设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。流式细胞术发展简史1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。流式细胞术发展简史现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：(1)细胞的组分是可以用分光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。(2)细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。Kamentsky不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。流式细胞术发展简史流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是VanDilla和美国的LosAlamos小组。他们在1967年首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。流式细胞术发展简史近年来，国内外在FCM上都做了不少的研究和应用工作，也取得了不少成果。特别是随着仪器和方法和日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作以扩大FCM的应用领域和使用效果。FCM在免疫组织化学中的应用也大致差不多，并注重了在临床应用的推广。流式细胞术的发展史流式细胞术的原理介绍流式细胞术在科研中的应用Overview流式细胞术简介流式细胞仪原理---利用激光激发高速匀速运动的带有各种荧光标记的微粒，并检测微粒由此产生的荧光和散射光，来反映微粒的各个参数。研究对象：生物微粒，包括细胞、微珠、染色体等。基本要求：能制成单个微粒的悬液。常用：细胞1,血液系统细胞2,培养的细胞、细胞系3,其他细胞：细菌、精子、单细胞浮游生物非细胞的其他微粒（病毒、染色体、核酸片段、乳胶微球等）微粒的大小限制：直径一般在1-30微米之间微粒的合适浓度：大约在5×105到5×106/mL之间流式检测的样品流式细胞仪结构图流式细胞仪结构图流式细胞仪的四大系统：1.流路系统（fluidicssystem)2.光路系统（opticssystem）3.电路系统（electronicssystem）4.分析系统（analysissystem）流动室：是仪器核心部件，流动室内充满了鞘液。液流系统---流动室与液