分离工程第八章.ppt

第八章 电泳 本章主要知识点 电泳的概念 电泳的基本原理 电泳技术的分类 常用的凝胶电泳技术有哪些？ 电泳装置的基本组成 聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程 SDS电泳的基本原理及过程 琼脂糖电泳的特点及其应用 等电聚焦电泳的基本原理 双相电泳的概念及其特点 电泳的简单原理 蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。 电泳：是荷电溶质在电场作用下发生定向泳动的现象。 电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。 20世纪初，电泳法用于蛋白质的分离，20世纪70年代，电泳多用于分析目的。 在电泳过程中，每个移动的界面相当于某一特定的蛋白质，通过一定计算可得其泳动度。 缺点：电泳中因通电发热等原因而引起的对流，常回使已分离的溶质重新混合，为防止对流，可将电泳在多孔介质中进行，称为区带电泳。 区带电泳：应用支持介质的电泳，它表示在一个电场的作用下，在某一支持物上能将一个样品组成彻底分离成若干条区带的过程。 （2）区带电泳：在支持物上电泳时蛋白质混合物被成若干区带。 根据支持物物理性质的不同可分为4类： 滤纸电泳和薄膜电泳，粉末电泳，细丝电泳，凝胶电泳。 多孔介质称为载体，应用最普通的是以滤纸或凝胶为载体故称为纸电泳法或凝胶电泳法。 第一节 凝胶电泳法 凝胶电泳的作用是基于凝胶过滤作用（分子筛作用）和电泳淌度的双重机理，所以它能获得较高的分辨率。 凝胶电泳：凝胶过滤作用（分子筛作用）电泳淌度正比于 电荷数（电荷效应） 单位电场强度下的运动速度称为离子淌度或迁移率。 聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应 在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Size sieving capacity），这种现象被称为分子筛效应（molecular sieving effect） 分子筛效应 常用的凝胶材料：聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶。 聚丙烯酰胺（丙烯酰胺）单体是神经毒素，可积累。 凝胶电泳使用的凝胶种类和浓度根据分离料液中溶质的相对分子质量而异。 聚丙烯酰胺含量 适用的分子量范围 7. 5%凝胶 10kD~1000kD 3.5%凝胶 1000kD~5000kD 琼脂糖或琼脂糖 与聚丙烯酰胺混合物 5000kD 孔径从小到大。 凝胶电泳与凝胶过滤的区别 在凝胶电泳中，样品混合物中各分子的运动速度是小分子大于大分子物质，这种凝胶过滤中的情况恰好相反，这是因为在凝胶电泳中，系统里没有空隙体积，只有充满整体凝胶的网状骨架，因此在其内部大分子物质不及小分子物质容易移动。 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： 由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。 因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。 PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳 电泳前的准备工作 缓冲系统的选择： 保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持； 电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGE可以在任何pH进行，但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解（脱酰胺）。因此，pH应限制在3~10之间。 缓冲系统的选择原则 是两种标准的对立权衡 如果缓冲液的pH选择在远离样品中各种蛋白的等电点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间短，区带细而窄； 如果缓冲pH选择在靠近被分离样品的一种或几种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷密度差别大，分辨率就高； 因此，常常选择pH 8.0~9.5的缓冲，常用的缓冲液有Tris-甘氨酸（pH 8.3~9.5），Tris-硼酸 pH 8.3~9.3 和Tris-醋酸（pH 7.2~8.5） 离子强度的选择 离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。 一般选择缓冲液的离子强度为0.01~0.1 mol/L之间 凝胶浓度的选择 由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密切相关。 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝胶分为： 非排阻性凝胶（unrestrictive gel）:浓度0.7 ~1.0%的琼脂糖凝胶； 排阻性凝胶（restrictive