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Western blot 实验技术 试剂配制 1. 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 1.0ml 溶解后，0.1ml分装 4℃保存，保存时间为1周。 2. 1.5M Tris·HCl（pH8.8） lower buffer（下层缓冲液） Tris 18.17g 超纯水 80ml 浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至100ml，过滤 ， 4℃ 3. 1.0M Tris·HCl（pH6.8）upper buffer（上层缓冲液） Tris 12.12g 超纯水 60ml 浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至100ml，过滤 ， 4℃ 4. 10％SDS SDS 5g 蒸馏水至 50ml 50℃水浴下溶解，室温保存。或者68℃水浴下溶解. 浓盐酸调pH至7.2 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 5. 30％Acr/Bic（29：1） 丙稀酰胺（Acr29g 甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g 超纯水至 100m 溶解后，过滤 ，4℃避光保存。 以上1-5可自行配制，也可购买SDS凝胶电泳试剂盒（博士德AR0138 or 碧云天 P0012）。 6. 5XSDS上样缓冲 （碧云天有售） 0.25mol/L Tris·HCl pH6.8 0.5mol/L二硫苏糖醇， 10％ SDS 0.5％溴酚蓝 50％甘油 7. 电泳液缓冲液 5x Running buffer Tris（MW121.14） 15.1 g 甘氨酸（MW75.07） 72 g SDS 5 g 蒸馏水至 1000ml 4℃保存 分离6－200KDa 8. 转移缓冲液 1x Transfer buffer 甘氨酸（MW75.07） 14.4g Tris（MW121.14） 3.03g SDS 0.2 g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml 4℃保存 9 . 染色液 500ml 考马斯亮兰 0.5g 甲醇 200ml 冰醋酸 50ml 水 250ml 10. 脱色液 500ml 无水乙醇 125ml 冰乙酸 50ml 水 325ml 11. PBS缓冲液 10x NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4·12H2O 36.151g Or Na2HPO4 14.4g K2HPO4 2.4g 蒸馏水至 1000ml 调pH至7.4 1 x PBST 1 x PBS 1000ml + 吐温20 1ml 12. 10X丽春红染液 丽春红S 0.2g 3g 磺基水杨酸 3g 蒸馏水至 10ml 使用时将其稀释10倍 13. 封闭液 5％脱脂奶 4℃保存 （完达山脱脂奶粉） 脱脂奶粉 5g PBST 100ml Stripping buffer 100ml β-巯基乙醇 0.69ml SDS 2g 1MTris HCl PH 6.7 6.25ml 也可采用30%H2O2,但洗脱能力较Stripping buffer弱。 15． PIERCE 或者 Millipore （P90719）的ECL发光液 分A,B液，用前1:1配制。 操作步骤 （一） 蛋白样品制备 50ml Tris 0.121g NaCl 0.146g NaF 0.105g 焦磷酸钠 0.112g 蔗糖 0.428g Lysis buffer Stock buffer 500 ul DTT （1M） 0.5 ul （DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇 蛋白酶抑制剂 5ul （sigma，P8340） 若研究磷酸化，加入Na3VO4 ，终浓度1mM。 备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下： 所有步聚均需在通风橱中进行： 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0 3. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至 9.0 6. 再煮沸至无色 7. 重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积 9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用. 1．称取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料离心管中。 2．加20 ml的0.01 M NaOAc pH5.2 ，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。 3．分装后－20oC保存。 （参照《分子克隆》二版P884） 此外，也可根据实验目的购买碧云天的RIPA裂解液，再加入蛋白酶抑制剂即可。Cooktail 蛋白酶抑制剂使用方法： 本抑制剂为片剂，为Roch公司的专利产品，干粉片剂4℃可以保存两年左右，使用前将本片剂溶于200微升去离子水中，于-20℃可以保存3个月，使用的