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生物基因工程专题报告 深圳源动力生物技术有限公司 一、原核基因工程上游技术 二、原核基因工程下游技术 一、原核基因工程上游技术 大肠杆菌表达系统的特点 遗传背景清楚，容易审批，例如：Amgen四个由E.coli生产并向FDA注册上市产品，年销售额超过二十亿美元。 容易大规模发酵 克隆和表达的各种载体和菌株齐全 背景文献丰富，上下游配套技术产品齐全 易形成包涵体，但近年来研究方向使得大量外源基因能在E.coli里正确折叠，如IL-11、G-CSF、GM-CSF、INF、IL-3、IL-6、Insulin、IL-2等均可获得正确折叠的重组可溶性活性蛋白 原核表达系统近年来研究取得突破性进展 1998年，美国Incyte Pharmaceutical公司华裔科学家Zhang Yang在《Protein expression and purification》(vol12,159-165)上发表论文《Expression of Eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli》，文章采用E.coli分子内伴侣DsbA技术将IGF-I、IGFBP-3、3Cproteinase、TGF(-2、STGF(-RII、BDNF、GDNF、mEGFBP、Leptin和GFP十个基因全部实现了可溶性表达，且表达量均大于25%。更为惊奇的是由于DsbA分子伴侣的作用使得拥有9个半胱氨酸的复杂结构的IGFBP-3能在E.coli内形成可溶性具生物活性的高表达重组蛋白。 2002年，美国冷泉港实验室出版的《Protein Science》(2002,11:313-321)上发表了瑞典科学家Torleif《Rapid screening for improved solubility of small human proteins produced as fusion proteins in Escherichia coli》一文，从而揭开了原核高效快速组合筛选表达系统用于蛋白组学研究的序幕。 近年来Medline报导了大量利用原核表达获得有活性的可溶蛋白，现举例如下： Gene Expression method Index Proinsulin DsbA fusion J.Biotechnol 2001 84(2):175-85 htPA DsbA coexpression Appl Environ Microbiol 1998 64(12):4891-6 Bovine enterokinase DsbA fusion Biotech nology(NY),1995,13(9):982-7 Mucin MBP fusion Protein Expr Purif 1999,15(1)146-54 Human angiogenin OmpA signal Biochem Mol Biol Int1999,47(2):267-73 Bacillus lipase OmpA signal Appl Microbiol Biotechnol 1998 Apr;49(14):405-10 HEV antigen Thioredoxin fusion Zhonghua shi yan he lin chuang bing du xue za zhi 2002,16(1):20-2 P55 TNF receptor Thioredoxin fusion Protein Expr purif 2001,23(2)226-32 hLH/CG receptor Thioredoxin fusion Endocrine 2001,14(2):205-12 Pokeweed antiviral protein MBP fusion Protein Expr Purif 1999,15(1)146-54 原核基因表达定位 表达的外源蛋白定位于胞内 表达定位在胞质膜上 分泌外源蛋白到胞周质 分泌到胞外培养基 表达外源蛋白定位于菌体表面如脂蛋白、外膜蛋白、鞭毛蛋白 影响大肠杆菌中外源基因表达的因素 1、表达载体的选择 2、密码子的选择 大肠肝菌偏爱密码子表附后 3、翻译起始区 4、宿主的选择及培养条件的控制 5、折叠酶共表达、分子内伴侣和分泌表达可最大程度地避免包涵体形成。 基因表达是一项很复杂的工作，由于特定蛋白可否在大肠肝菌中按需要表达，目前尚无法预知，比较可行的办法是同时试验多种表达方法。 基因高效快速表达试剂盒 深圳源动力生物技术有限公司代理美国基因动力实验室的原核基因高效快速表达试剂盒将九种表达载体包括分泌型、引导分泌型、胞内直接表达型