16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱地地分析微生物菌群.docVIP

最近看到一本书《环境基因组学实验指南》其中第十七章题目为“16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群”，它作为一个实验技术写进实验书里，比看期刊，论文更有所帮助。我将这一章编写的内容全部敲下来给你，希望对你的实验有所启示和帮助。 第十七章16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群 概论 过去几十年中，利用所谓的生物标记物来检测环境样本中的微生物菌群的分子微生物生态学（molecular microbial ecology）得到了快速的发展。许多分子可以作为生物标记物，包括细胞壁成分、蛋白质、脂类、DNA或RNA，尤其是核糖体RNA（rRNA）小亚基和相应基因的应用在微生物生态学的发展中发挥了重要的作用。目前已经建立了几种应用于环境样本中的微生物群落的指纹特征分析方法，其中最常用的方法是PCR扩增片段的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），DGGE可以根据序列将相同长度的DNA片段混合物分开，分离的原理使基于DNA片段在含有梯度变性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝胶中的序列特异性融点不同实现的。DGGE能对微生物群落进行快速的分析和比较，利用DGGE可使组成的多样性一目了然，其中每一条带原则上代表一种细菌系群，染色后，在凝胶中DNA分子停止迁移的位置会看到条带，理论生，DGGE指纹图谱可以区分一个碱基对的差别。 关键词：食本芽孢杆菌（Bacillus benzoevorans）；DGGE；指纹图谱；16S rRNA基因；土壤微生物 引言 微生物菌群对于地球上甚至地球外的几乎所有环境的发展和功能是至关重要的，而针对一系列细胞生物标记物的分子微生物生态学方法的长足发展，使得对微生物群落组成和功能的检测可以不依赖于微生物的培养（1，2）。靶向生物标记物可以是在不同的分类水平表明特定微生物种存在的任何生物成分，包括细胞成分如细胞壁成分、蛋白质、脂类、DAN或RNA。即使细胞死亡后这些分子仍可以被检测到。这使得我们可以研究微生物群落并追踪其在不断变化的环境条件下的发展过程，所以包括历史标本，储存的样本（风干保存用于后续分析的样本）甚至考古样本这些不可能用培养的方法获得微生物的材料都可以得到研究（3-5）。微生物生态学可以很方便的应用核糖体RNA小亚基（SSU rRNA；细菌和古细菌的16S rRNA，真核生物的18S rRNA）和对应的基因作为生物标记物。以这些分子作为靶点，可以利用很多互为补充的分子技术来检测不同环境下总的细菌、古细菌和真核生物群落，以及特定的感兴趣的微生物种类。多以SSU rRNA基因检测作为普遍的系统发育标记物的分子指纹图谱方法，常被用于在分子微生物生态学中快速检测不同时间或空间中微生物群落组分的变化，结合数理统计分析，这些技术是研究不断变化的环境因子如何影响微生物群落构成的有力工具（6,7）。 几种类型的梯度凝胶电泳已经被有效地应用于环境样本中微生物群落的观察。最常用的是变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE），而最新出现的是结合了DGGE和TGGE的主要原理的时间温度梯度凝胶电泳。DGGE在微生物生态系统的首次应用是在对海洋生态系统中的细菌多样性分析（9）。凝胶电泳技术在快速比较不同环境中个微生物群落和检测某一特定的群落在不同时间多个成员内的组成变化的研究中非常有效。 DGGE是一种利用序列差异来分离同样长度DNA片段混合物的技术（10）。分离的原理是基于DNA片段在含有梯度变性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝胶澳中的序列特异性融点不同实现的，在5’端引入GC夹（GC-Clamp）可保护DNA片段不会完全变性。这个GC夹有30~50bp长，是在进行DGGE分析之前加到对靶基因进行PCR扩增的一个引物上的，理论上，在不长于500bp的PCR扩增产物上的单个碱基对差异都可以被鉴定出来，在变性梯度中，不同序列的片段将停留在不同的位置。 材料 2.1 利用试剂盒（Fast DNA SPIN Kit）分离DNA Fast DNA SPIN Kit（用于土壤）（Q BIOgene，Cambs，United Kingdom）是商品话的DNA分离试剂盒，在实验室中常用于广泛的环境介质检测，包括土壤、沉积物、排泄物。也可用于其它DNA分离方法。 2.2 PCR PCR可以用Taq聚合酶在PCR仪上进行。 不加模板DNA，先准备基本组分： 1、5μL10×PCR缓冲液（10×缓冲液：200mmol/L Tris-HCl，pH8.4，500mmol/L KCl） 2、3μ