第5章表达载体2014资料.pptVIP

2、可溶性蛋白的纯化 融合蛋白的表达标签可用于分离纯化目的蛋白 分泌表达载体也有助于分离纯化可溶性的表达产物。 可溶性的表达产物一般可展现应有的蛋白质活性。 * 不同微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。 如70%的抗生素来源于放线菌，如以寻找抗菌抗肿瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主较理想，而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。 * * 穿梭载体(shuttle vector)：能够在两类不同的宿主中复制、增殖和选择的载体，主要是质粒，它们至少有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。 通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。 第二节 穿梭载体 * 一、大肠杆菌/革兰氏阳性菌穿梭载体：如向枯草芽孢杆菌的穿梭。 二、大肠杆菌/酵母菌穿梭载体：主要用于遗传学和真核表达研究，尤其是当蛋白需要进行真核修饰时，如磷酸化、糖基化等。 三、其它穿梭载体：如动物病毒载体、植物转化的Ti质粒、昆虫杆状病毒等，更为复杂一些。 第三节 整合载体 当外源基因整合到宿主细胞的染色体后，可以稳定地遗传，进而达到稳定表达的目的。 整合载体：将某个基因或某些基因插入到染色体中去的载体。 根据整合方式的不同可分为定点整合和随机整合。 根据其作用可分为目的基因的插入或敲除以及随机突变体库的构建。 * 3.1 基因插入/基因敲除 同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体不仅含有大肠杆菌克隆载体的骨架，更主要的是含有一段便于同源重组的重组DNA片段。 * 3.2 随机插入突变载体 随机突变体库——指标记基因在载体的携带下通过DNA重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。 * （1）、微生物插入突变载体 转座子是一类在细菌的染色体、质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列。 以pEG922为例，其可用于革兰氏阳性细菌插入突变体库的构建。 该载体上含有在革兰氏阳性细菌中复制和选择的复制区（该复制区是温度敏感型的，在42℃下不能复制）和氯霉素抗性基因。 * 插入突变体库的构建 将装载了一个四环素抗性基因的转座子Tn5401插入到载体pEG922中 →将该载体转化到革兰氏阳性细菌 →转座子发生一定频率的转座 →在42℃下筛选仅有四环素抗性的菌落 →得到的菌落就是发生转座的突变子（由于在高温下载体不能复制，随着细胞的分裂，载体就会丢失，只有发生转座事件的菌体才能表现出四环素抗性的表型。） * 2、构建植物突变体库所用的载体 根瘤农杆菌介导的T-DNA插入或植物转座子标签是植物基因功能研究中常用的产生突变体的方法。 （1）T-DNA插入突变体 根瘤农杆菌介导的T-DNA插入到植物基因组时往往会导致插入位点的基因遭到破坏，从而可构建用于基因功能分析的突变体。 * （2）植物Ac-Ds转座子双因子插入突变 这套系统利用玉米的Ac-Ds转座子系统来构建突变体。 Ac是玉米染色体上一个完整的转座子，含有转座酶基因，但缺少末端反向重复序列；Ds是Ac缺失转座酶基因的缺失体，但两端的反向重复序列仍然存在，Ds在有转座酶存在的条件下可发生转座。 * 构建突变体步骤 分别构建Ac（可合成转座酶，但缺少末端反向重复序列）和含Ds（不能合成转座酶，只含末端反向重复序列）的质粒载体，再分别转化农杆菌并用于转化异源植物。 转化植株杂交后，就可获得即含Ac又含Ds的植株。 在这些植株中转座子事件就会发生，通过选择标记筛选突变体。 利用Ac-Ds作探针，可钓出与突变有关的基因。 * Ac Ds Ac 缺失一端反向重复序列 内部缺失 -Ac 不能自主转座，但可以表达转座酶引起Ds转座 Ac Ds 不能自主转座，需借助其他转座酶 转基因植株1 转基因植株2 × 杂交子代（即含转座酶基因，又具反向重复序列的植株约占1/4） * （3）构建动物随机插入突变体文库常用载体 在动物功能基因组研究中基因陷阱是建立大规模随机插入突变、鉴定基因功能的有力工具。 基因陷阱的基本原理是通过携带有报告基因的载体随机整合到动物染色体，干扰内源基因的功能，并标记被插入的基因。 动物的转化方法与植物不同，一般采用电转化、反转录病毒转染等。 * * 内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。其毒性成分主要为类脂质A。内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障