第7章测序资料.pptVIP

3.3 ABI SOLiD sequencer 它基于连接酶测序法，即利用DNA连接酶在连接过程中进行测序。原理： 第1轮测序：体系中加入DNA连接酶、通用测序引物n和具有3’-XXnnnzzz-5’结构的八聚核苷酸。第1和第2位（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在第6-8位（zzz）上加了不同的荧光标记。这种由两个碱基决定的测序方法被称为两碱基测序（two base encoding）。 当八聚核苷酸由于配对而被连接酶连接上时，会发出荧光。在记录下荧光信息后，通过化学方法在第5和第6位之间进行切割，淬灭荧光信号，以进行下个位置的测序。 通过这种方法，每次测序的位置都相差五位，即第一次测第1和第2位，第二次测第6和第7位……在测到末尾后，将新合成的链变性、洗脱。 ★ 用通用测序引物n-1进行第2轮测序。通用测序引物n-1与通用测序引物n的差别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基，即通用测序引物n-1在通用测序引物n配对位置上向3’端移动了一个碱基。因此在加入DNA连接酶和八聚核苷酸后，可以测定第0和第1位、第5和第6位…… 第二轮测序完成后，接下来再分别加入通用测序引物n-2、通用测序引物n-3、通用测序引物n-4进行第3轮、第4轮、第5轮测序，最终可以完成全部位置的测定，并且每个位置均被测定了两次。 过程： （1）待测DNA文库的构建把待测序列打断成很小的片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建ssDNA文库。 （2）Emulsion PCR与454技术的Emulsion PCR类似，将带接头的ssDNA固定在磁珠表面，进行PCR扩增，并对扩增产物进行3’端修饰。 （3）连接酶测序将3’端修饰的磁珠沉积于上样玻片（slide），进行连接酶测序。在沉积过程中可对磁珠密度进行调节，以达到最大通量。 信号处理 4.第三代测序技术 （1）Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术(切割法） 一种基于电信号测序的技术。以α-溶血素为材料制作纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。碱基在纳米孔内的平均停留时间是毫秒级的，它的解离速率常数与电压有关，180 mV的电压就能够保证在电信号记录后将碱基从纳米孔中清除。 纳米孔测序技术 ☆ 新型纳米微孔只有1个纳米大小，仅够用来测量一个DNA的单分子链。研究人员把微孔放在一层浸泡在氯化钾溶液中的膜上，并施加一个小的电压，让电流通过微孔。不同的核苷酸通过纳米微孔时，回路中的电流就会随之改变，这些电流称为特征信号。胞核嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶这些DNA的基本组成要素，会生成不同的特征信号。 纳米孔技术也可以用于识别个体DNA如何被修饰的，这些修饰，比如表观遗传学DNA修饰能随着细胞内化学反应，应答不同环境条件的变化。 DNA通过纳米孔的运动速度要慢，使得每秒通过纳米孔的核酸碱基数为20至30个，从而有可能对每一个经过纳米孔的碱基进行识别 （2）DNA通过纳米孔，直接读取序列信息的技术 读取数据更快、有望大大降低测序成本 单分子测序，不需要扩增，可识别碱基修饰，时间短 * 1977年提出的方法 * * * 桥式PCR完成后每个位点形成的DNA簇是两种互补的序列，因此芯片上的两种接头引物在PCR扩增完后其中一种被裂解冲洗掉后才能得到只有1种序列的基因簇。 第7章 DNA测序方法及原理 主要内容 1.手动测序的主要方法和原理 1.1 Maxam-Gilbert化学降解法 1.2 双脱氧法测序 2.第一代全自动测序方法和原理 2.1 双脱氧法测序 2.2 DNA芯片测序 3. 第二代全自动测序方法和原理 3.1 焦磷酸法测序 3.2 可逆阻断合成法测序 3.3 连接酶测序 4.第三代测序技术（纳米孔单分子测序技术） 测序的意义 了解基因及调控序列（元件）的特点 有助于发现新的基因，并确定其功能 有助于确定各物种之间的进化关系 有助于对遗传疾病的诊断及治疗 有利于对DNA的操作和后续分析 有利于确定基因型与表型之间的关系 测序技术的发展 1977-80s 人工手动测序 90s 全自动测序技术（第一代） 2000年，高通量平行测序技术（第二代） 2010年，单分子高通量平行测序技术（第三代） ★ 1.手动测序的主要方法及原理 1.1 Maxam-Gilbert化学降解法 1.1.1 基本原理 用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不