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聚合酶链反应 和 琼脂糖凝胶电泳 丁洁 2014.10.24 实验目的： 1. 了解聚合酶链反应的定义、原理和方法。 2. 学会利用聚合酶链反应体外扩增核酸。 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理、方法。 4. 学会PCR仪和UVP凝胶成像系统的使用。 实验原理： 聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction，PCR），是体外酶促反应合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。 PCR原理示意图 实验原理： 通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 基本反应步骤构成： 1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2.模板DNA与引物的退火 复性 ：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 PCR 实验原理： 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。DNA分子带负电荷，在电压的驱动下，由负极向正极移动。 实验仪器： 移液枪、EP管（200 ul）、 普通台式离心机、涡旋混匀器、PCR仪、制胶盒、微波炉、凝胶电泳槽、UVP凝胶成像系统、烧杯等 实验试剂： Taq DNA聚合酶、dNTP、引物primer（mt DNA）、Mg2＋的缓冲液、双蒸水、琼脂糖、Goldview、TAE 0.4mM Tris-Hcl, 0.02mM EDTA 、TE 、6*Loading buffer、marker（DL2000）等 实验步骤 1.样本定量 模版的浓度过高，会造成样本浪费，甚至可能抑制聚合酶链反应的进行。在PCR体系中，模版终浓度在10ng/ul为最适浓度。PCR体系为15ul，故取用1ul浓度为10ng/ul的模版较为合适。 模板稀释至10ng/ul，相当于将100mg/ul样品稀释10倍（100ul的样品中加900ul水）。 实验步骤 2.反应体系配制 组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、Taq DNA聚合酶、dNTP以及含Mg2＋的缓冲液。所有试剂由冰箱取出化开后需涡旋并短暂离心。 配制除模板外所有试剂按比例混合，如需25份样品，按30倍的试剂用量配制，先加双蒸水，再加其余试剂，可充分与水混合。 1份 30份 50份 水 5.35 ul 160.5 ul 267.5 ul 10*Taq buffer 1ul 30 ul 50 ul dNtp （稀释后） 1ul 30 ul 50 ul 引物 PM 0.2ul 6 ul 10 ul Mg 2+的缓冲液 1.2ul 36 ul 60 ul Taq DNA聚合酶 0.25ul 7.5 ul 12.5 ul 模版 1 ul 实验步骤 3. 反应体系14 ul分装至0.2ml ep管。 4. 将模版1ul加至反应体系中混合，涡旋震荡，短暂离心。 5. 上机进行扩增反应。ep管上PCR扩增仪进行反应，约1小时。硅胶盖膜防止反应体系的挥发。 94℃ 3min 94℃ 30S 62℃ 30s 30cycles 72℃ 1min 72℃ 6min 4℃ hold 实验步骤 6. 在反应进行过程中配制琼脂糖凝胶： TAE100ml加琼脂糖1g在锥形瓶中，微波炉加热至沸腾在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。 倒胶：干净的胶槽内放置底板，摆好梳子，往胶内滴加3uL左右核酸染料（Goldview），混匀，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。倒平板一定要缓慢，这样可以避免倒板中出现气泡。配凝胶溶液的时候搅拌一定要轻柔缓慢，不然易出气泡。 拔梳：待大约20min后，轻轻拔掉梳子（若不好拔，可以滴加适量的TAE缓冲液）。将凝胶放入电泳槽里，加样端放在阴极（黑色）方向，加1*TAE缓冲液页面高于胶体。 实验步骤 7. 将凝胶放入电泳槽里，加样端放在阴极（黑色）方向，加1*TAE缓冲液页面高于胶体。 8. 加样，将2ul的6* Loading buffer与10ul的反应产物在薄膜上混合后吸取12ul加样。 上样时依次是模板，marker，及pcr产物。 9. 电泳（100v ，30分钟） 。 10. 用凝胶成像系统观察实验