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荧光显微镜 Fluorescence microscope 姓名：符彩涛 学号：1座机电话号码 导师：刘芳 目录 透射式荧光显微镜 反射式荧光显微镜 荧光显微镜 概述 1.概述 强度及韧性高、导电导热性好、抗冲击能力强 1.1 荧光 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 荧光的性质 1.概述 强度及韧性高、导电导热性好、抗冲击能力强 自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光。 二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光。 自然荧光 二次荧光 1.2 荧光的种类 2.荧光显微镜 2.1 荧光显微镜 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置的一类显微镜。 荧光显微镜的种类 透射式 反射式 导热性能 耐热性能 散热性能 偶极子在交变电场中的作用示意图 荧光显微镜是一个利用高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光物质发射各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。 2.2 基本原理 2.荧光显微镜 荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 2.荧光显微镜 2.3 荧光显微镜的结构 由普通光学显微镜的基础上加上一些附件 如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等 组成。 荧光显微镜结构图 导热性能 耐热性能 散热性能 3.透射式荧光显微镜 3.1 概述 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。对观察较大的标本材料较好。 主要特点是低倍镜时荧光强，随放大倍数增加其荧光减弱。 导热性能 耐热性能 3.2 透射荧光显微镜的结构 3.透射式荧光显微镜 汞灯光源 激发滤色器 暗场聚光镜 吸收滤光镜 导热性能 耐热性能 散热性能 3.3 原理图 3.透射式荧光显微镜 导热性能 耐热性能 散热性能 3.4 优缺点 3.透射式荧光显微镜 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜。 容易形成暗的背景，得到良好的反差； 任何物镜都可用于观察； 用低倍物镜时，比反射荧光镜更亮。 缺点： 必须正确调节聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚载玻片。 视场照明区不能过大，否则容易使荧光色衰退。 厚的或不透明的标本不适用。 优点： 4.反射式荧光显微镜 4.1 概述 这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45°角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。 4.反射式荧光显微镜 4.2 反射式荧光显微镜的结构 4.反射式荧光显微镜 4.3 原理图 4.反射式荧光显微镜 4.4 优缺点 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 物镜数值孔径不受限制，在高放大倍率时，也可以获得高分辨率的像。 厚的或不透明的标本能观察，厚的盖玻片也能使用。 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法相结合。 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。 优点： 缺点： 在使用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用大数值孔径的物镜。 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。 4.反射式荧光显微镜 4.5 主要应用 现在反射荧光显微术已被广泛用于 实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移 FRET ATP 酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化 生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动 4.反射式荧光显微镜 4.5.1 在生物单分子科学中的应用 全内反射荧光显微镜可以直接对细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰。 全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分 子动力学的最有前途的光学成像技术。 4.反射式荧光显微镜 4.5.2 在生物单分子科学中的应用 利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图 4.反射式荧光显微镜 4.5.2 蛋白分子相互作用 通过荧光标记的分子共同定位运用全内反射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。 分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子 co-chaperon GroES或者其底物乳球蛋白的相互作用已经在单分