荧光细胞化学测定分析.pptxVIP

荧光细胞化学测定实验目的学习荧光显微镜的使用了解荧光显微镜技术原理与方法了解荧光技术在细胞化学方面的应用使用荧光显微镜观察洋葱表皮细胞实验原理荧光显微技术某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。荧光显微镜即利用特殊照明装置发出较短波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光，通过物镜作用在样品上，在有目镜观察到肉眼可见的荧光。荧光自发荧光次生荧光不同组分，不同活性的细胞，反应产生的荧光也不同。显微镜使用操作步骤基本操作步骤安装紫外防护罩打开高压汞灯的电源控制箱开关（打开后不立即关闭…15min，关闭后待冷却后再开…30min）（工作环境温度不宜过高，用不宜过长…300h）插入挡光板中断光路预热5-10min将载有样品的载玻片放到载物台上（载玻片不宜过厚，盖玻片可添加特殊干涉盖玻片，标本不宜过厚，镜油）选择接物镜（按照先低倍，后高倍顺序）旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件：“O”为观察投射光使用；“WU”为观察蓝色荧光时用；“WB”为观察绿色荧光时用；“WG”为观察红色荧光时用。使用阻断滤片（内置）通过粗、细螺旋调整焦距。打开与显微镜链接的计算机，点击数码成像系统软件，采集数码图像。实验用品材料：洋葱用品：荧光显微镜，载玻片，镊子，烧杯等。试剂：0.01％吖啶橙生理盐水溶液0.02％异硫氰酯荧光素生理盐水溶液0.0l％罗丹明生理盐水溶液荧光增白剂溶液，将荧光增白剂溶于0.4M山梨醇溶液中，使浓度达到0.1％。实验方法利用荧光增白剂观察植物细胞壁DNA分布的观察蛋白质分布的观察线粒体观察植物细胞壁有强烈的吸附染料的能力，最常用的是荧光增白剂检查原生质体细胞壁是否分解完全；原生质体再生细胞壁的鉴定。在植物原生质体培养时,原生质体细胞壁的再生是决定原生质体成活、生长、分裂的关键。用荧光增白剂染色,可在荧光显微镜下见到发蓝色荧光的再生壁。在有细胞壁的情况下可观察到绿色荧光，而在经纤维素水解酶处理过的原生质体中只能观察到叶绿体发出的红色荧光。吖啶橙（acridineorange，AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。荧光素是一种应用非常广泛的荧光示踪物。在水中，其最大吸收/发射波长为521/494纳米。荧光素的衍生物异硫氰酸荧光素（FITC）带有异硫氰酸反应基团，使其朝着对生物分子常有的胺和巯基进行反应）Rhodamine是一种可以通过细胞膜的选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，呈黄绿色荧光。广泛用作检测线粒体膜电位，也常用于细胞凋亡检测。它可以快速通过细胞膜，仅需几分钟就可以被具有活性的线粒体所俘获，并且对细胞没有任何毒性。THANKYOU