琼脂糖凝胶电泳总结.pptVIP

Thanks DNA/RNA的琼脂糖凝胶电泳 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 注意事项与实验技巧 凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术； 分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。 根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳 一、实验原理 （1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 （2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 分离长度 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 200bp—近50kb 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5—500bp 分辨率高 采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子。 含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量 [%（W/V）] DNA/RNA分子的分离范围（ kb ） 0.3 5—60 0.6 1—20 0.7 0.8—10 0.9 0.5—7 1.2 0.4—6 1.5 0.2—3 2 0.1—2 二、实验仪器、材料与试剂 质粒样品、酶切样品和PCR样品。 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。 琼脂糖、 1XTAE电泳缓冲液、溴化乙锭、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA分子量标准等。 凝胶电泳系统 DYY-6C型 ?双稳定时电泳仪电源（北京六一） 输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)????? 4-400mA?(1mA)????? 240W  美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell ?凝胶成像分析系统 DNA Marker 一个已知分子质量的DNA样品做对照，用来确定待测样品的相对分子质量。 常用电泳缓冲液 缓冲液 缓冲容量 迁移速度 分辨率 用途 TAE 最低 最快 (高10％) 高分子量高 高度复杂DNA混合物；超螺旋DNA TBE 很高 较慢 低分子量高 价格昂贵，不常用 TPE Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。 缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性。 常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE，其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。 上样缓冲液 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 EB染料 溴化乙锭（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，它在标准的302mm紫外光照射下能发射橙红色信号，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。 EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出，效果较好；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，有剧毒，使用时一定要戴手套，且一定要注意等到琼脂糖凉到四十多度的时候再加EB，否则EB有一定的挥发性，而鼻黏膜对EB的吸收是较明显的。 EB废液要经过净化处理再行弃置。 SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，但操作不便，信号不稳定，易猝灭，价格较昂贵。 Goldview:主要成分吖啶橙，高毒，在相当程度导致细胞凋忘。较便宜，但效果不及EB。 三、实验步骤 1. 制备琼脂糖凝胶（1%） 2. 制备凝胶板 3. 加样 4. 电泳 5. 染色 6. 结果观察 　 二、实验方法 1．50×TAE的稀释：如制备50mL 1×TAE，取1mL 50×TAE加入49mL水定容至50mL。 2．制备1%的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于20mL TAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至40℃.(加入浓度为10mg/mL的EB 2μL，使EB的终浓度为1μg/mL)。 3．用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3% 的H2O2溶液，于室温放置1