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AKP的纯化以及Km的测定 ——结果分析以及实验介绍 组员：柳毅浩 张佳薇 周坤 谢金容 Contents 结果展示与思考 1 离子交换层析 2 A510值 活性单位 蛋白质浓度 AKP比活性 A 0.035 1.98 0.437 4.53 B 0.023 1.3 0.294 4.42 C -0.002 — 0.004 — D 0.005 0.11 0.032 3.44 标准管 0.062 1 结果展示与思考 注：C组数据出现负值不能使用，作图时弃掉此点 1 结果展示与思考 因为AKP在30%的乙醇 或33%的丙酮中是溶解 度最大的，浓度增大或 减小使其溶解减少 原因分析 第一次加入95%乙醇 时误加多 第一次加入丙酮后 实际体积和计算体积 相差较大 实验操作错误 1 结果展示与思考 原因分析 移液器和滴管滴加后体积不同，但两者均会 造成有机溶剂浓度偏高 措施：根据第一次加入后总体积修正第二次 加入体积。 水的错误加和 1 结果展示与思考 原因分析 加入正丁醇充分搅拌后静止不分层 过滤速度过慢 加入预冷有机溶剂时速度过快 分光前振荡不充分或者气温较低 反应缓慢 其他 1 结果展示与思考 2.离子交换层析 影响因素 PH大小 交换剂和待分离样品离子化程度发生改变 吸附平衡关系改变 洗脱液与样品组分竞争离子交换剂吸附位点 离子强度 影响样品各组分洗脱分离效果 2.离子交换层析 洗脱液的选择 1.注意PH的改变 2.逐步提高洗脱液中无机盐（NaCl等）的浓度（根据样品各组分对于交换剂亲和力的影响） 准备 装柱 1.流出口套乳胶管 2.蒸馏水冲洗层析柱 3.排空 4.关闭流出口 1.待交换剂自然下沉至柱底，打开流出口放出部分液体 2.重复前一步直到1/2柱高 不干床！不分层！无气泡！ 平衡 1.打开层析柱流出口 2.用缓冲液Ⅱ平衡5个柱床体积 3.调整流速至3s/d 2 离子交换层析 上样 缓冲液与层析柱面相平时，用滴管加入部分纯化的AKP，尽量保持顶面平整 阶段梯度洗脱 1. 25ml缓冲液Ⅱ 2. 25ml 40mmol/LNaCl缓冲液Ⅱ 3. 25ml 80mmol/LNaCl缓冲液Ⅱ 4. 25ml 120mmol/LNaCl缓冲液Ⅱ ATTENTION: 1、相平 2、平整 2 离子交换层析 阶段梯度收集 1.加入35ml 200mmol/LNaCl缓冲液Ⅱ，立刻收集6管，每管5ml，流速1ml/min 2.关闭层析柱流出口 收集管AKP比活性测定 浓缩液收集 2 离子交换层析 1）各管AKP活性 方法基本同部分纯化AKP (注意:波长510nm) 2）蛋白质定量测定 AKP活性较高收集管液 0.5ml 已知浓度蛋白质标准液 0.5ml +考马斯亮蓝G-50 2.5ml 混匀，室温5min 以0.15mmol/L NaCl作空白管对照，波长595nm处比色 2 离子交换层析 预祝大家本次实验成功~ Thanks