免疫共沉淀.pptxVIP

免疫共沉淀;CO-IP是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 ;;优点： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点为： （1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果。 ;;;实验步骤： 1. 处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。一般3×106细胞/处理(即六孔 板一个孔，约200ug总蛋白)。 2. 配IP 裂解液（RIPA buffer）：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实 验结果则应加入磷酸酶抑制剂。注意抑制剂的要现加现用。 3. 收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解 液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。;4. 细胞裂解，是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA, 但可能会影响蛋白质之间的相互作用。 5. 离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。 6. Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm× 2分钟，吸掉上清备用。;7. 细胞裂解液预清洗：为去除非特异作用，细胞裂解液先用Agrose-proteinA/G预清洗。 转移步骤5离心好的细胞裂解液上清至步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中，4度翻转1小时。 8. 抗体和Agrose-proteinA/G预孵育：为减少游离抗体消耗抗原造成IP效率下降，将抗体 和Agrose-proteinA/G进行预孵育。在步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中加入200ul含0.1%BSA 的IP 裂解液及相应量的抗体，4度翻转1小时。不同抗体时间可能有不同。 ;9. 抗原抗体孵育：步骤7和8后进行离心（5000rpm 2分钟），将预清洗好的细胞裂解液 转移到含预孵育好的抗体和Agrose-proteinA/G 的EP管中，4度孵育过夜。 10. 洗IP复合物：步骤9后离心（5000rpm 2分钟），吸掉上清，加入IP裂解液（一般不用 加抑制剂）500 ul，弹匀后4度摇转5分钟，重复6次。最后一次离心后加入3×SDS 60ul。 11. WB检测。