土壤红基因组论文答辩论述.pptVIP

赤水河流域茅台段土壤宏基因组的提取及检测 姓 名：张世冲 指导老师：肖仲久 材料 * * * 目 录 背景和意义 材料 方法 结果与讨论 赤水河流域因其独特的水质、土壤、气候等自然环境，造就了高品质国酒茅台等一系列白酒，其中，这些环境中的微生物资源是影响白酒品质的主要因素之一。从赤水河茅台段采集土壤，提取土壤微生物宏基因组，再进行扩增测序，可为后续构建高质量宏基因组文库奠定了基础. 研究背景和意义 样品采集：本实验所用的土壤样品取自于赤水河流域 酶和试剂 ：E.Z.N.A. Soil DNA Kit试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司，其他试剂均为国产分析纯，PCR引物由天根生化公司合成 主要仪器：PCR仪:S1000TM Thermal Cycler（Bio-Rad）,WD-9413A凝胶成像分析仪（北京六一）、EM-259EB1微波炉（三洋）和Miro17R Centrifuge离心机（Thermo Scientific） 土壤微生物DNA的提取： 按照OMEGA Bio-Tek公司E.Z.N.A. Soil DNA Kit试剂盒说明略作修改进行提取电泳分析 采用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳 方法 PCR扩增 反应体系：引物27F（5‘AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、 1492R（5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）各0.5μl，dNTP 2μl，10×Taq Reaction Buffer2.5μl，MgCl21.5μl，Taq酶0.5μl，模板1μl，ddH2O 16.5μl，总体积25μl。 反应程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环,最后72℃延伸10min。 方法 结果 土壤微生物的提取 PCR扩增 2000bp---- 2000bp---- 750bp------ 结果 扩增产物测序结果：1号样本1400bp， 2号样本1326bp。 在线 BLAST结果表明：1号样本与Psychrobacter（嗜冷杆菌属）,细菌同源性达99%;2号样本与Paracoccus(副球菌属）,细菌同源性达97%。 讨论 1.土壤中提取宏基因组的方法可以分为两类：一是直接法(细胞原位裂解)；另一类是间接法(细胞回收)。用直接法提取尽管得到的DNA中包含的腐殖酸、粘粒和多糖等抑制物的量较高，但相对步骤要简单，提取的DNA的含量也相对较高，所以此次实验采用的是直接法。 讨论 2.在对土壤DNA提取时，刚开始使用的步骤完全是按照OMEGA Bio-Tek公司E.Z.N.A.Soil DNA Kit试剂盒提供的步骤进行操作，但是提取了2次都没有结果，后来对其中二个实验步骤的条件进行了改变：一是向样品中加入100ul Buffer DS 后放入90℃（提供的步骤中是70℃）的水浴锅中加热，以此使难溶解的细菌细胞壁溶解，加速细菌细胞破壁，以利于细菌DNA的释放；二是加入冷的异丙醇后放入冰箱3h（提供的步骤中是1h）。 讨论 3.在跑电泳时，刚开始得到的条带模糊弥散，而且DNA Marker 条带没有分开，后来更换了缓冲液，再次电泳得到了清晰的条带，可见缓冲液在多次使用后，其电泳效果会有影响，影响了DNA分子的迁移。 * *