分生讨论人类细胞质RNA的提取摘要.pptxVIP

人类细胞质RNA的提取 宣讲人：张蓝月 制作人：张蓝月，张婧靓，李婧婧 RNA是基因表达的中间产物，真核生物的RNA存在于细胞质、细胞核以及线粒体中。其中细胞核RNA包括不均一核RNA（hnRNA）、核小RNA（snRNA）等，细胞质RNA包括rRNA、tRNA和mRNA等。 RNA的性质 为多元酸，具有较强的酸性，是线性高分子。 通常以单链形式存在，但可以通过链内的碱基配对形成局部的双链二级结构和空间的高级结构。 一些非编码RNA参与基因表达的调控。 在紫外波段有较强的光吸收，在中性条件下，最大吸收值在260nm附近。 根据260nm处的吸光度，可以确定出溶液中的RNA含量；利用A260/A280还可以判断所提取的核酸样品的纯度，RNA纯品的A260/A280应为2.0 具有不稳定性。 RNA的不稳定性 由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA 易于被RNA酶切割水解。 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活。 所以提取RNA时必须在无RNA酶的环境中在提取RNA的过程中需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性，保护RNA分子不被降解。 常用的RNA酶抑制剂 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：是由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：是从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 细胞质RNA提取的一般步骤与常用方法 一般步骤 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA 常用方法 由于RNA的种类和来源很多，因而提取制备方法各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法（即Trizol法）实验室最常用。 工业上常用稀碱和浓盐酸法提RNA，且用这两种方法提取的核酸均为变性RNA，主要用于制备核苷酸。 Trizol法提取细胞质RNA的优点 无论是人、动物、植物还是细菌，Trizol法对其均有较好的分离效果。 TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个样品，所有的操作可以在一小时内完成。 TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat.No. 18068)来处理抽提的总RNA。 TRIZOL 试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA 的析出。 Trizol法提取细胞质RNA的基本原理 由于细胞内的大部分RNA是以核糖体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。 组织匀浆后再通过苯酚、氯仿等有机溶剂处理离心，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。 Trizol法提取细胞质RNA的试剂 苯酚、异硫氰酸胍、B-巯基乙醇、氯仿、异丙醇、乙醇等 因为这些试剂都会影响后续实验，所以要用酒精洗一到两遍。 提取缓冲液中一般含SDS（十二烷基硫酸钠）、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNA酶活性，并有助于除去非核酸成分。 Trizol法提取细胞质RNA的步骤 破碎组织 RNA分离 RNA沉淀 RNA洗涤 RNA 异丙醇 RNA的上清液 提取细胞质RNA的应用及意义 分析不同发育时期基因的表达状况 获得新基因 研究基因的拼接 分析相应的蛋白产物 获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。