医学检验实验指导资料.doc

《临床检验基础》 实验指导 （供医学检验专业五年制本科使用） 遵义医学院医学检验系组编 2005年12月 第一章 外周血常规检验综合评价实验 【检验流程】 实验一 红细胞计数 【目的】 掌握显微镜红细胞计数（red blood cell count）方法。 【原理】 用等渗稀释液将血液稀释一定的倍数，充入计数池后，在显微镜下 计数一定体积内的红细胞数量，经换算求出每升血液中的红细胞数量。 【器材】 显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒。 【试剂】 红细胞稀释液（Hayem液）：氯化钠1.0g，结晶硫酸钠5.0g（或无水硫酸钠2.5g）蒸馏水加至200ml。溶解后加20g/l伊红溶液1滴，过滤后使用。 【标本】 外周血或抗凝血（EDTA抗凝）。 【操作】 稀释液 取小试管1支，加红细胞稀释液2ml。 2．加血 用清洁干燥微量吸管采集末梢血或抗凝血10ul，檫去管外余血，轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上清夜清洗吸管2~3次，立即混匀。 3．充池 混匀或用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放3~5min，待细胞下沉后于显微镜下计数。 4．计数 用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个方格内的红细胞数。 5．计算 红细胞/L=N×25/5×10×106×200=N×1010=N/100×1012 N ： 表示5个方格内数得的红细胞数。 25/5 ：将5个大方格内数得的红细胞数换算成1个大方格的红细胞数。 ×10 ：将1个大方格红细胞换算成1ul血液内红细胞。 ×106：1L＝106ul 200：为血液的稀释倍数。 【注意事项】　 采血时不能过分挤压采血部位，针刺部位深度必须适当。 采血应顺利、准确，采血部位不得有水肿、发绀、冻疮、炎症等。红细胞数量增高时可适当加大稀释倍数。 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则。避免多数或漏数。 稀释液要过滤，小试管、计数板均须清洁干燥，以免杂质、微粒等被误认为是细胞。 如无上述稀释液时，也可用新鲜配制的等渗盐水代替。 将细胞悬液充入计数池时要一次完成，不能产生满溢、气泡、或充池不足的现象。 红细胞在计数池中若分布不均，每个方格之间相差超过20个以上时要重新充池计数。正常数值范围内，2次红细胞计数相差不得超过5%。 【方法学评价】 目视计数法是传统的的红细胞计数法，不需要特殊设备，但操 作复杂、费时。 【质量控制】 1．计数评价　在细胞计数的评价中，多采用两差比值（r）评价。 2．稀释　造成稀释倍数不准确的常见原因有：①稀释液或血液加样不准确。②吸血时吸管内有气泡。③未檫去吸管外血。④血液加入稀释液时使上清液浑浊，血液被吸管带出。⑤稀释液放置的时间过长，蒸发浓缩。 【参考值】 ①成年男性：（4.0～5.5）×1012／Ｌ。 ②成年女性：（3.5～5.0）×1012／Ｌ。 ③新生儿： （6.0～7.0）×1012／Ｌ。 实验二 血红蛋白测定 氰花高铁血红蛋白测定法 【目的】 掌握氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定方法。 【原理】 在血红蛋白转化液中，除硫化血红蛋白外，其余血红蛋白均可被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与氰离子（CN-）结合，生成稳定的复合物氰化高铁血红蛋白（hemoglobin cyanide，HiCN）。棕红色的氰化高铁血红蛋白在波长540nm处有吸收峰，可用校正的高精密分光光度计进行直接定量测定，或用HiCN参考液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。 【器材】 一次性消毒采血针，微量吸管，试管。5ml移液管，75%（V/V）乙醇棉球，无菌干棉球，分光光度计，试管。 【试剂】 1．HiCN转化液（文齐液）氰化钾（KCN）50mg，高铁氰化钾[K3Fe（CN）6]200mg，无水磷酸二氢钾（KH2PO4）140mg，Triton X –100 1.0ml，蒸馏水加至1000ml，纠正pH至7.0~7.4。此液淡黄色透明溶液，用蒸馏水调零，比色杯径1.000cm，波长540nm处的吸光度应0.001。贮存在棕色有塞玻璃瓶中，放4℃冰箱保存，一般可保存数月。如发现试剂变绿、浑浊不能使用。 2．HiCN标准液（200g/L）商品试剂。 【标本】 外周血。 【操作】 1．直接定量测定 （1）加转化液：试管内加5mlHiCN转化液。 （2）采血与转化：取全血20ul，加到盛有转化液的试管底部，用上清液反复冲洗吸管3次，充分混合，静置5min。 （3）测定：以符合WHO标准的分光光度计（常规测定时带宽应小于6cm）。波长540nm处，光径（比色杯内径）1.00