医学细胞生物学-2015-第二次课资料.ppt

4.3 基因治疗 人们把siRNA 技术引入到c-myc功能的研究中,通过体外合成的c-myc-siRNA 抑制急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞的c-myc表达活性, 成功地抑制了Jurkat细胞的增殖。 RNAi可以特异性的抑制基因表达，所以可用于基因病、病毒感染、癌症的治疗。 4.2基因功能的研究 Fraster等利用RNAi技术分析了线虫I号染色体上80％以上的基因。并且发现了1772个基因的RNAi表型。有研究将siRNA注射到线虫胚胎中筛选了Ⅲ号染色体上大约90％的基因，并确定了其中133个基因是必须的，分析了这些基因的功能。这两个试验为利用RNAi研究哺乳动物全基因功能的研究奠定了坚实的基础，在全基因组功能研究中应用RNAi技术也会日趋成熟。 Zimmermann等人对猕猴的阿朴脂蛋白B (ApoB)编码的基因施用siRNA，成功降低ApoB蛋白、血清胆固醇和低密度脂蛋白的水平。 这是首次在非人类灵长类动物中有关RNAi的全身用药，是RNAi在药物治疗方法上的重要进展。 4.3 基因治疗 蛋白质相互作用的研究技术 免疫共沉淀可验证蛋白质-蛋白质相互作用 酵母双杂交用于筛选存在相互作用的蛋白质 噬菌体展示可筛选存在相互作用的蛋白质 一 免疫共沉淀原理 以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。 如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？ Y-X-抗X 实验基本原理 1.提取蛋白 2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体 3.孵育后再加入Protein A或G(于Agarose bead上) 若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—Protein A或G 3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体） proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合 agarose bead 琼脂糖珠 三 实验流程 提取细胞总蛋白 ↓ ↓ 离心，上清电泳(抗原抗体) 准备PA珠子，PBS洗3遍 ↓ PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景) ↓ 离心去PA珠子，取上清 ↓ 测蛋白浓度 (BCA法) ↓ 加一抗反应(4℃过夜) ↓ 加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4℃过夜) ↓ 离心，收集沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍 ↓ 上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子 ↓ ↓ 实验过程 （1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠耦联； （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟； （6）SDS, Western blotting或质谱仪分析。 固相萃取 * * 重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的