扫描电镜与透射电镜样品制作(完全版).docVIP

相关仪器的信息： ? 透射电镜：JEOL(公司 JEM-1230（型号） TEM，产地：日本 ?超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利 扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克 ? 临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本 ? ? 包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USA 表1 戊二醛溶液的配制 终浓度 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0 0.2M PBS/ml 50 50 50 50 50 50 50 25%戊二醛水溶液/ml 4 6 8 10 12 16 20 重蒸水加至/ml 100 100 100 100 100 100 100 表2 0.2M磷酸缓冲液（PBS）的配制 A液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液 Na2HPO4 28.4g 或Na2HPO4.H2O 31.61g 或Na2HPO4.2H2O 35.6g 或Na2HPO4.7H2O 53.63g 或Na2HPO4.12H2O 71.64g 加双蒸水至1000mL NaH2PO4 24.0g 或NaH2PO4.H2O 27.6g 或NaH2PO4.2H2O 31.21g 加双蒸水至1000mL 按下表比例混合A、B0.2mol/L的母液，其中pH7.0为常用配方 pH值 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 A液 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7 B液 92.0 87.7 81.6 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 5.30 在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。 表3 多聚甲醛-戊二醛固定液的配制 溶液名称 剂量 10%多聚甲醛溶液 20ml 0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液 50ml 25%戊二醛水溶液 10ml 重蒸水 20ml 表4 2%锇酸溶液的配制 试剂 用量 锇酸/g 1 重蒸水/ml 50 表5 Spurr包埋剂配方 药品名称 硬配方 软配方 我们现用的配方 VCD树脂 10g 10g 10g DER736 6g 7g 8g NSA 26g 26g 26g DMAE 0.4g 0.4g 0.4g 注：通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。DMAE的用量则调节聚 合反应的速度。  透射电镜样品制备程序： No.1 包埋切片样品的制作过程 样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品： 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 用1%的锇酸溶液固定样品1-2h； 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min。 用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h； 用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h； 纯包埋剂处理样品过夜； 将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在日本JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察。 1).Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer, once for 15min; then postfixed with 1% OsO4 in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and wa