用于末端烯烃生产的酿酒酵母组合代谢工程优化资料.ppt

用于末端烯烃生产的酿酒酵母组合代谢工程优化 汇报人：XXX 学号：2062015XXX 班级：硕士X班 武汉青山区石油化工厂生产废气 研究背景 天大研发大规模生物乙烯工厂 减少石油生产燃料，使用可再生的低碳方法生产燃料迫在眉睫 研究背景 生产洗涤剂、润滑液 高内能 兼容的碳氢化合物燃料添加剂 兼容现有发动机平台 应用层面不断扩大 市场需求巨大，现有生产方法污染大 经济和环境层面上，生物烯烃的代谢工程方法开发具有很高的需求 试验思路 利用酿酒酵母来构建一种一步脂肪酸脱羧途径来生产末端烯烃，并利用组合工程策略来提高烯烃的产量 A 试验方法及结果讨论 I.筛选在酵母中进行烯烃生物合成的酶 使用来自于Jeotgalicoccus sp的细胞色素脂肪酸脱羧酶oleTJE 用作脂肪酸脱羧基转化为末端烯烃(Rude et al., 2011) 从它的密码子优化版本oleTJE-CO和它的六个同源基因中进行筛选 将这些基因克隆进高拷贝质粒pESC-URA，然后转化进入酿酒酵母 诱导蛋白表达由使用抗6×多聚组氨酸标签抗体(HRP)的蛋白质印记方法确认 细胞培养生长48小时后定量分析比较烯烃的产量，定性分析烯烃的种类评估上述不同酶的表现 试验方法及结果讨论 I.筛选在酵母中进行烯烃生物合成的酶 使用酵母细胞组合oleTJE同源染色体进行烯烃的生产。oleTJE-CO、oleTSM、oleTMC、oleTSP、oleTBS、oleTMP和oleTCE的过度表达产生了不同链长烯烃的分布。从C11到C19，不同链长的烯烃用不同的颜色表示。 试验方法及结果讨论 II.增加游离脂肪酸的产量 Why? ACC1:乙酰辅酶a羧化酶 将ACC1进行过度表达，并且阻断FAA1和FAA4这两个主要的脂肪酰基辅酶的合成途径。 试验方法及结果讨论 II.增加游离脂肪酸的产量 How? 在强诱导型启动子PGAL1和PGAL10的控制下对含ACC1的oleTJE-CO进行过度表达 菌株BY11（ACC1，oleTJE-CO） 剔除掉FAA1和FAA4后表达oleTJE-CO 产生了三种不同的菌株BY12(Δfaa1, oleTJE-CO)、BY13(Δfaa4,oleTJE-CO)和BY14(Δfaa1Δfaa4,oleTJE-CO) C 试验方法及结果讨论 III.辅因子的工程改造 a.辅因子的添加：亚铁血红素和过氧化氢 添加亚铁血红素：oleTJE是细胞色素P450酶，它包括亚铁血红素作为辅因子，而细胞色素P450酶的过度表达会引起亚铁血红素的损耗。 添加过氧化氢：OleTJE在过氧化氢中十分活跃，因为，过氧化氢是它唯一的电子和氧气供体来源。 添加亚铁血红素：+87%，添加过氧化氢的：+79% 两者都添加：+262% 最高产量：1.4mg/L 试验方法及结果讨论 III.辅因子的工程改造 b.HEM3的过度表达，CTT1, CTA1和CCP1的剔除 a中辅因子工程的方法来通过消除对辅因子的需求，这样做的代价比较大 控制血红素合成过程中的限速酶，使其过度表达来提高细胞血红素的产量 剔除掉CTT1, CTA1和CCP1基因来产生过氧化氢酶缺陷菌株 只有BY16表现出相对于BY14略微较高的烯烃效价 两种方法协同效应生成的BY17相对于菌株BY14，产量提高了23%， 试验方法及结果讨论 IV.烯烃的基因表达调优 通常情况下，富培养基可以增加细胞的生长而使最终细胞量增加，从而使得烯烃的产量也有所提高。 使用含KanMX抗性标记的pRS质粒来替换营养缺陷型pESC-URA质粒 使用pRS41K (low copy) and pRS42K (high copy)作为克隆载体 使用PGAL1 (a strong inducible promoter),PPGI1 (a weak constitutive promoter) and PTEF1 (a strong constitutive promoter) 在所有的载体中来调控oleTJE-CO的转录。 BY22包含了强组合型启动子PTEF1在低拷贝型质粒pRS41K上，表现出了很高的烯烃产量，2.1mg/L，比BY17高4.4倍，比对照组菌株BYJECO高38.3倍 在弱启动子PPGI1调控下的包含oleTJE-co的菌株在高拷贝质粒pRS42K (BY21)上的烯烃产量比低拷贝质粒pRS41K(BY20)的烯烃产量高2.2倍 i)在低拷贝质粒上使用强启动子可以为烯烃生产提供足够的酶水平 ii)在高拷贝质粒上使用强启动子可能会在细胞中产生“代谢压力”，使所有的途径对宿主酵母细胞无益 试验方法及结果讨论 V.生物反应器过程优化 使用BY22 (Δfaa1Δfaa4Δ