23重组DNA技术解释.ppt

第四篇 遗传与变异 23 重组DNA技术 23 重组DNA技术 重组DNA技术，也称基因工程或遗传工程。 基因工程是指将特定的基因（即外源基因），通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中与受体细胞的基因进行重组，并能增殖、表达，这样一种遗传学操作。 基因工程的主要目的:通过与优良性状相关的基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种或新产品。 23 重组DNA技术 23.1 基因工程的相关技术 23.1.1 核酸的分子杂交 1. DNA的变性与复性 DNA变性 较高温度DNA解链成单链。 DNA复性 变性的DNA逐渐冷却，分离的两条单链通过碱基互补配对重新恢复成双链的DNA分子。 短链容易精确复性；长链复性较难。 杂交分子 不同来源的单链DNA，只要碱基序列大部分互补，就可以复性。 DNA与RNA之间，也一样可以通过碱基互补配对形成杂交双链分子。 23 重组DNA技术 2. 分子探针寻找特定基因 放射性标记的DNA或RNA分子。 3. Southern印迹 可以检测特定的DNA序列。 23 重组DNA技术 4. Northern印迹 可以检测特定基因的表达情况。 5. 原位杂交 可以检测特定细胞中某一基因的表达情况。 23 重组DNA技术 23.1.2 PCR 1. PCR技术的基本原理 PCR反应过程： ●双链DNA变性（90℃～95℃）成为单链DNA； ●引物复性（37℃-60℃）同单链DNA互补序列结合； ● DNA聚合酶催化（70℃～ 75℃）使引物延伸。 23 重组DNA技术 2. Taq DNA聚合酶 耐热 3. 寡核苷酸引物 4. PCR技术的应用 基因克隆、特定DNA序列鉴定（基因鉴定、DNA指纹识别） 23 重组DNA技术 23. 2 基因工程主要的工具酶 23.2.1 限制性内切（核酸）酶 （1）限制性内切酶的作用 识别DNA中特定核苷酸序列，使每条链的一个磷酸二酯键断开。 （2）限制性内切酶的类型 I型、II型和III型。 II型酶→基因工程。 （3）限制性内切酶的命名 根据来源命名。如EcoR I →大肠杆菌（E. coli）、R株系、第一种。 23 重组DNA技术 （4）限制性内切酶的识别序列 能识别的特定核苷酸序列。 4~6个碱基对组成，且碱基互补对称。 只写单链的核苷酸序列。 （5）限制性内切酶的切割位点 II型酶切割位点在识别序列区内。 23 重组DNA技术 （6）切割片段的末端 A.粘性末端 两条链末端交错对称。 ● 5 粘性末端 ● 3 粘性末端 B.平头末端 两条链末端平齐。 23 重组DNA技术 23.2.2 DNA连接酶 催化-PO4和-OH形成磷酸二酯键。 （1）E. Coli DNA连接酶 大肠杆菌（E. Coli）基因组编码； 连接具互补粘性末端的DNA片段。 （2）T4 DNA连接酶 T4噬菌体DNA编码； 既连接具互补粘性末端的DNA片段，也能连接平头末端。 23 重组DNA技术 23.2.3 反转录酶 从反转录病毒中制备得到的。 该酶能以具有3′-OH 的DNA或RNA为引物，以mRNA为模板从5′→3′聚合生成cDNA 。 23 重组DNA技术 23.3 基因(克隆)的质粒载体 基因载体 运送外源DNA片段进入受体细胞。 需具备三个条件：●有插入位点； ●能在受体细胞内复制； ●有筛选标记基因。 23 重组DNA技术 质粒 A.存在于细菌；蓝藻、绿藻、真菌。 B.染色体外裸露环状双链DNA分子，小的不足1500bp，大的100kb以上。 C.宿主细胞内能自主复制。分为松弛型和严紧型复制两种类型质粒。选用分子小和松弛型复制的质粒（即有高的拷贝数）。 23 重组DNA技术 质粒载体pBR322 A.有复制起始点，能在受体细胞内复制； B.有2种筛选标记基因； C.有允许外源DNA插入的位点； D.有高的拷贝数。 23 重组DNA技术 23.4重组DNA的基本步骤 23.4.1 获得目的基因 1. 构建基因组文库分离目的基因 2.人工合成DNA 3.利用反转录酶构建cDNA文库分离目的基因 4.用PCR技术从基因组中扩增特定的基因片段 23 重组DNA技术 23.4.2 DNA分子的体外重组 酶切和连接。 23 重组DNA技术 23.4.3 重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 1. 重组DNA引入宿主细胞 原核生物细胞是很好的受体细胞→容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作。大肠杆菌、蓝藻、农杆菌等。 2. 重组体克隆的筛选与鉴定 抗性筛选；鉴定的证据越充分越好。 2