第4讲核酸分子杂交技术重点.pptVIP

主要内容 第一节 分子杂交技术的理论基础 第二节 核酸分子杂交的方法 第三节 核酸杂交的探针 一、DNA变性与复性 核酸分子杂交实验步骤： 印迹转移：将核酸样品转移到固相支持物滤膜上 主要三种方式：毛细管虹吸作用 真空抽滤作用 电场作用 常用的固相支持物(滤膜) 尼龙滤膜 硝酸纤维素滤膜 叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM） 二乙氨乙基纤维素滤膜（DEAE） 滤膜的选择 核酸的特殊性、分子大小 杂交过程中所涉及的步骤的多寡及敏感性等参数 硝酸纤维素滤膜：不能滞留小于150bp的DNA片段 不能同RNA结合 广泛变性后的RNA很容易转移到硝酸纤维素滤膜 （P.S.Thomas, 1983） 改变缓冲液可以改善硝酸纤维素滤膜对小片段DNA的滞留能力 (G.E.Smith,1980 :1mmol/L CH3COONH4和0.2mmol/L NaOH缓冲液代替SSC) 尼龙滤膜 较为理想的固相支持物 结合核酸能力强 转膜后可多次重复使用（每次杂交的探针可以洗去而结合的DNA酶切片段不容易被洗去） 缺点： 杂交信号的本底较高 Western印迹杂交 检测的蛋白质经PAGE凝胶电泳并染色后，转移到滤膜上固定，然后用“抗原-抗体”免疫反应或“DNA-P