第二章培养基总结.ppt

第二部分内容： 原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养法）。 细胞生长状况的观察。 培养细胞一代生长过程。 传代。 冻存与复苏。 细胞培养注意事项（如细胞污染）。 细胞培养的一些专业术语介绍（如细胞株、系，上皮细胞型、成纤维细胞型） 第一部分：动物细胞用液的制备 配液前准备： ①滤器、滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、注射器。 贮液瓶（生理盐水瓶）、瓶塞、15磅，121℃，20分钟蒸气灭菌 ②NaHCO3、NaOH、HCl、胎牛（小牛）血清、青霉素、链霉素、三蒸水、培养基粉剂 配液过滤无菌操作要求： 操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟 操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口。 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行 离子交换水： 离子交换水中仍有一些非离子物质及有机物，一般在细胞培养中较少使用。 双蒸水、三蒸水： ? 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水  超纯净水： 采用进口的RO膜、离子交换膜、离子交换树脂、抛光核子级树脂、静音高压泵、电磁阀等，产品性能得到最大化的保证； 分子生物学、生命科学、基因研究、组织培养、试管婴儿、生物工程、动物细胞培养、培养基制备、DNA测序、氨基酸分析、疾控中心、水质检测中心、药检所、质检所、高校科研等标准实验室及各种高端精密仪器用水。 （二）、平衡盐液体（Balanced salt solution, BSS） ： 组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 如： PBS、 Hanks 用途：用于洗涤组织、细胞或配制消化液时等 平衡盐液体： 组成 无机盐、葡萄糖 种类： 氯化钠浓度、离子浓度、缓冲系统不同 Earle——NaHCO3含量高、缓冲能力高，5%CO2平衡 Hanks——NaHCO3含量低、缓冲能力低，空气平衡 D-Hanks——不含钙、镁离子 Dulbecco——含少量钙、镁离子 PBS ——磷酸缓冲系统 PBS（Phosphate-Buffered Sallines） D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) （三）、消化液——分散组织、细胞 作用： （1）在进行原代培养过程中需分散组织、细胞。 （2）在传代中要使细胞脱离附着的底物时均需使用消化液。 类型： 组织细胞培养中常用的消化液为胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠（EDTA）及胶原酶溶液，可以分别单独使用或混合使用。 称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐（或PBS）溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%）。 如果短期内要使用，就放置4℃冰箱。 EDTA·4Na 溶液： 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长（E-cadherin) EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4℃冰箱保存 联合使用： 胰蛋白酶和EDTA联合使用可提高消化效率(细胞与细胞之间的粘附分子需要Ca2+: cadherin, selectin, integrin). 但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。 联合使用： 常用的配制方法（0.25%trypsin-0.04%EDTA溶液）： 胰蛋白酶0.25 g，EDTA0.04 g，PBS(-)液100 mL，烧杯内磁力搅拌充分溶解，0.22μm滤膜正压过滤，-20℃冰箱保存。 （四）、pH 调整液： NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存 （五）、HEPES溶液： 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mmol/L（分子量238.31）溶液 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌