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反相色谱柱的选择 Waters Asia Ltd. 内容简介 合适的选择性 色谱峰之对称性 重现性 柱间与批次间之重现性(Column-to-Column vs. Batch-to-Batch) Waters色谱柱质量控制(Certificate of Analysis) Waters 方法认证包(Method Validation Kit 高性能与宽适用范围 对HPLC色谱柱的要求 合适的选择性 满足不同的分离要求 良好的色谱峰形 重现性 宽应用范围 C18 填料的合成 端基封口(Endcapping) 在第一步主要的配体(C18)键合后,第二步键合过程。目的是“覆盖”未反应的硅羟基 使用小硅烷 (TMCS) 降低硅羟基活性 (有利于碱性物质获得好的峰形) 在pH2时,封口之短链烷基水解迅速 为什么这些硅胶反相C18填料如此不同? 色谱测试结果显示: 疏水性不同 残留硅羟基活性不同 为什么? 不同 C18配体键合水平(状况) 配体密度 不同硅胶颗粒基质 密度,表面积,孔径 纯度 小结: 填料的疏水性以及残留硅羟基活性是决定色谱柱选择性的重要因素,因此,在选择色谱柱时应充分了解填料的性质。 色谱柱选择性比较表对合适色谱柱的选择具有指导意义。 对HPLC色谱柱的要求 合适的选择性 良好的色谱峰形 定量精度、灵敏度与分辨率 两项改善色谱峰形的新技术 重现性 宽应用范围 对称峰形的益处 更准确与精确的定量结果 纯度分析 稳定性分析 更高的灵敏度 更好的检出限与定量限(LOD and LOQ) 对低浓度杂质有更强的检测能力 更强的分辨能力 -更好的分辨率 更有利于相邻色谱峰的分离 色谱峰对称性的衡量方法 由于拖尾引起的积分误差 由于拖尾引起的灵敏度差异 峰形对分辨率的影响 何种原因导致不好的峰形? 以碱性物质为例 硅胶颗粒中金属离子的浓度 硅醇(羟)基与碱性物质之相互作用 金属离子浓度对色谱峰形的影响 何种原因导致不好的峰形? 以碱性物质为例 硅胶颗粒中金属离子的浓度 硅醇(羟)基与碱性物质之相互作用 如何克服硅羟基作用? 七十与八十年代: 容忍碱性物质拖尾现象存在,使用流动相改性剂改善色谱峰形 九十年代以后: 改进反相色谱填料颗粒技术,降低不尽人意的硅羟基相互作用,内嵌极性基团技术 小结: 色谱峰形的好坏是准确定量的决定因素 新型内嵌极性基团技术、杂化颗粒技术能够有效地改善色谱峰峰形。 高纯度硅胶填料的色谱柱具有优异的色谱峰形。 对HPLC色谱柱的要求 合适的选择性 良好的色谱峰形 重现性 色谱柱间重现性 批次间重现性 宽应用范围 为什么重现性如此重要? 重现性是液相色谱分析的基本要求 缺乏重现性是用户最担心的问题 加快方法验证(Validation)的速度 更容易传递方法 instrument-to-instrument, and lab-to-lab 确保长期符合认证及系统适应性等要求 — 更容易符合法规要求 柱间重现性与批次间重现性的区别 同一批次合成的填料—色谱柱之间的重现性 柱床填充质量控制 塔板数 色谱峰对称性 反压 无选择性差异 不同批次合成的填料—色谱柱批次间重现性 颗粒的物理性质 表面之化学性质 Waters — 严格的质量控制 所有原料的质量控制 填料生产过程控制 物理化学性质检验 Characterization of Packing 高质量,有色谱意义测试实验 — 确保批次间重现性 小结 反相色谱填料的选择性与批次间重现性与硅胶的质量及键合相的生产过程密切相关 填料批次间重现性对方法长期之重复性至关重要 对HPLC色谱柱的要求 合适的选择性 良好的色谱峰形 宽应用范围 分析速度 温度范围 pH 范围 有机硅烷化试剂与硅胶表面的硅羟基反应引入C18键合相,改变了填料的选择性(保留时间)。 端基封口都有效的减少了硅羟基的数量。 但是,即使进行高密度键合,硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)! 而另外一项新技术的引进,减弱因碱性化合物阳离子交换而引起的保留作用,从而改善碱性化合物峰形。 对不同品牌的C18色谱柱选择性的研究结果显示:填料键合相疏水性的不同和硅胶基质上残留硅羟基的活性 不同归根结底 填料的物理、化学性质(硅羟基的作用),键合相的种类、数量 在pH中性流动相的条件下,分别以二氢苊和阿密去替林(碱性化合物)为样品的测试结果。x轴表示填料疏水性的变化,y轴表示硅羟基活性的变化。图中左侧填料的保留往往小于右侧。而底部填料的硅羟基活性弱于顶部的,因此,实现含有碱性化合物的样品分离选择图中底部的填料可以避免碱性化合物的拖尾。 良好的色谱峰形的重要性以及新型的改善色谱峰性的方法。 With Symmetry columns, less mobile phase m
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