第十四章动物基因工程方案.ppt

第十四章 动物基因工程 主要内容 第一节、动物基因工程的发展现状与趋势 第二节、动物转基因技术 第三节、转基因动物制备 第四节、转基因动物鉴定与安全评价 第五节、转基因动物的应用与展望 第一节 动物基因工程的发展现状与趋势 动物基因工程是指利用DNA重组技术对动物所进行的工程操作。 目前已经先后生产出转基因小鼠、大鼠、家兔、绵羊、山羊、猪、牛、鸡和多种鱼类 1982年Palmiter硕鼠 原核显微注射法 大鼠生长激素基因 转基因小鼠 体重是非转基因小鼠的2~4倍 一、精细与安全的动物遗传修饰新技术 二、转基因动物将成为有限自然资源高效利用的主力军 1. 高效转基因技术逐步成为动物基因工程的主流 2. 从外源基因随机插入（或整合）到定点整合的转变 3. 对外源基因控制更加精细与安全 第二节 动物转基因技术 动物基因工程载体 载体相关调控元件 基因转移技术 物理法、化学法和生物法 动物基因工程载体 功能: 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。 为外源基因提供在受体细胞内复制或整合的能力。 为外源基因提供在受体细胞内的表达能力。 分类: 过表达载体 敲降载体 敲除载体 过表达载体 1）通用型表达载体 通用型表达载体可使携带的目的基因高效表达，而且一般无物种或细胞类型的特异性，是研究基因功能的有力工具。 CMV启动子 MCS（Multiple Cloning Site） SV40 ori(SV40 origin) pUC ori（pUC origin） 新霉素抗性盒（neor） 过表达载体 2）组织特异性表达载体 利用特定的调控元件构建真核表达载体，驱动目的基因在特定组织中表达，这样的载体称为组织特异性表达载体。 β-酪蛋白(β-casein)基因启动子 β-globin insulator：鸡球蛋白基因的隔离子 Ampicillin (bla) ：氨苄青霉素抗性基因 E1、E2、E7、E8、E9： β- 酪蛋白外显子1(非编码) IVS7、IVS8： β-酪蛋白基因的内含子 过表达载体 3）条件控制表达载体 可以人为控制其所携带的目的基因的时空表达。 Te t- On系统原理示意图 敲降载体 荧光素酶报告基因系统筛选RNAi靶点原理图 敲除载体 1）同源重组技术 通过外源基因与靶细胞染色体上的同源序列间的同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞特定染色体的确定位置上，或使某一个特定位点上的基因发生定点突变的技术。 打靶型基因敲除载体结构 敲除载体 2) 基因敲入 基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色体的特定位点上。 同源重组与随机整合细胞系的筛选示意图 敲除载体 3) 锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)技术 锌指酶靶DNA结合示意图 每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，从而达到 DNA 定点剪切的目的。 敲除载体 4） TALENs技术 利用氨基酸序列与其靶点DNA序列有恒定的对应关系，构建与核酸内切酶FokI的融合蛋白，在特异性位点打断目标基因组DNA序列，从而可在该位点进行DNA编辑修饰。 TALENs作用靶点基因组DNA位点产生双链断裂后，不同修复机制应用示意图 载体相关调控元件 1.Cre/Lox系统 3. 绝缘子（Insulator） 2. MAR序列，基质结合区 MAR在一定程度上提高了转基因的平均表达水平，同时也可以降低不同转化体之间转基因表达水平的差异。MAR具有的这种转录增强作用与与该基因的整合状态及拷贝数有关。 Cre酶是来自于噬菌体P1的重组酶，能催化具有相同或相似的特殊序列位点两条DNA链间的重组，根据参与反应的LoxP 的方向和相对位置，Cre酶可以分别催化DNA的整合、切除或重组等多种反应。 绝缘子既是基因表达的调控元件也是一种边界元件，能够阻止临近的调控元件对其所界定基因的启动子增强或抑制作用，以将表达域保护起来。 基因转移技术 1．动物细胞的物理转染法 电击法(Electroporation) 其基本原理是在外加短暂高压电脉冲的作用下，细胞膜电位发生改变，细胞质膜瞬间形成纳米级的微孔。外源DNA通过这些微孔或者伴随微孔关闭时膜成分的再分布而直接进入细胞内，并进一步整合到宿主DNA上，达到转基因目的。 (2) 显微注射法(microinjection) 显微注射法是将外源DNA在显微操作系统的辅助下，通过玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使外源基因整合到基因组上 (3) 超声波转染法(S