醋酸纤维素薄膜电泳解答.pptVIP

影响电泳迁移率的因素： 1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和所带电荷的多少、蛋白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离 子强度和电渗现象 * * 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳 陈艳　李秀清　张伟　孙金山 ——第三组 那么什么是电泳？ 定义：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象。　　　　　　　　　　　　　　　　　　 负极 正极 － 迁移率（mobility)：表示单位电场强度粒子的速度。 又叫泳动度，用 μ表示。 μ＝v/E=Q/(6πrη) 可知，在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。 电泳的应用：分离各种有机物；分析某种物质的纯度及分子量。 原理 电泳为何能分离混合物？ 等电点（pI) 当蛋白质溶液在某一pH下，蛋白质解离为正负离子的程度及趋势相等时，此时溶液的pH为蛋白质的等电点。 pH＞pI，蛋白质感受＂碱＂，此时它产生负电荷，向正极移动。 pH＝pI，电场中不移动。（注意：并不是说此时蛋白质不带电） pH＜pI，蛋白质感受＂酸＂，此时它产生正电荷，向负极移动。 H＋ OH－ H＋ OH－ pHpI pH=pI 　　 pHpI 以生物大分子为例 迁移率与电荷量成正比，与相对分子质量成反比。 电压越高，速度越快。但高电压　　介质温度升高　　样品扩散和对流速度增加　　　分辨率降低。低电压会延长电压时间，但可以减少产热。所以，实验中我们要选择合适的电压，同时要冷却降温。 缓冲液的ｐH决定了生物的解离程度。对于蛋白质和氨基酸来说，我们知道溶液的pH离等电点越远,，所带的净电荷越多，迁移速度越快。因此选择一个合适的pＨ，使各种蛋白质所带的净电荷数量差异越大，以利于分离。缓冲液要求性能稳定，不易电解。 同时，缓冲液的离子强度会对自身缓冲能力有影响。过高，缓冲能力差，过高则会阻碍分子的迁移，使样品速度减慢。 １样品性质 ２电场强度 ３缓冲液的性质 影响电泳分离效果的因素 热不利于电泳 热蒸发缓冲液，影响缓冲液的离子强度，甚至导致样品变质。 热会增加样品的扩散 为了减少热对实验的影响，可控制电泳或电流，也可安装冷却完散热装置。 。 ４支持介质 ５温度 理想的介质：具有网状结构，不带电荷，对分离物质无吸附作用的惰性材料。 网状结构：提高电泳分辨率 电渗：降低分辨率。导致电渗的原因是支持介质表面存在带电基团。 吸附：降低电泳分辨率。（常用支持介质中，高纯度的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的吸附最小，醋酸纤维素薄膜次之，滤纸最大 电渗作用： 电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。 以纸电泳为例: 正极 － － － － － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 负极 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向负极移动 如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。  电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳技术的优点：快速，准确，重复性好。 电泳分类： 按装置的差异有：薄膜电泳，垂直板电泳，平板电泳，垂直圆盘电泳和毛细管电泳 按支持介质有： １ 醋酸纤维素薄膜电泳：分辨率高，成本低，灵敏度高，应用广泛。 ２ 琼脂糖凝胶电泳：操作简单，分辨率高，重复性好，结果可定量分析，电泳后易洗脱。 ３ 聚丙烯酰胺凝胶电泳；灵敏度高，对pH和温度变化较温度，应用广。 ４ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有聚丙烯酰胺凝胶电泳的所有优点。 ５　等电聚焦电泳。 ６　双向电泳：具有极高的灵敏度和分辨率。  氨基黑10B ：蓝色酸性染料，可与蛋白质结合形成青色结合物。灵敏度为考马斯亮蓝R-250的20%。 考马斯亮蓝R-250:可通过非共价键与蛋白质结合，适用于微量SDS-蛋白质染色。 银染　染色机制与摄影过程中Ａg离子的还原相似，灵敏度比考马斯高100倍。常用于凝胶低电泳中极微量蛋白质的染色。 蛋白质 蛋白质的染色方法 实验目的 实验原理 实验步骤 注意事项 1 2 3 4 掌握电泳的基本原理，了解电泳仪，电泳槽的基本结构和功能。熟悉电泳的基本过程与定量方法。熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。 实验目的 实验原理 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。 血清中各种蛋白质的等电点在pH4.88～7.50之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电