0324细菌转化实验.pptVIP

实验一 细菌质粒DNA的提取和纯化 菌体pcr 跟普通PCR原理是一样的，因为94度变形可以裂解细菌，释放出DNA，所以不用提质粒也可以PCR出来条带 一、实验目的 通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。 二、实验原理 细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。 三、实验菌株 含质粒载体pGEM-T的大肠杆菌（E. coli.） 四、实验用具和药品 实验用具 摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及塞子、离心管（1.5mL）。 实验药品 五、实验步骤 方法：活化-扩增-离心-裂解-离心-抽提-沉淀-洗涤-溶解 （一）细菌繁殖 实验前2天晚上： 将冻存的菌株取出，划线接种于LB（amp）平板上， 置于37℃培养箱中，倒置培养至菌落长成。 实验前1天晚上： 从LB平板上挑取单个菌落，接种于6mlLB液体培养基（加入氨苄青霉素）中，37℃，过夜振荡（200r/min）培养。 （二）菌体收集 实验当天 ： 将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心2min； 弃上清 （三）碱裂解法提取质粒DNA 全套操作约需1小时，详细说明如下。 3. 加入250 μl的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。 4. 加入250 μl的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。 注）此步骤不宜超过5分钟。 5. 加入400 μl的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。 6. 室温12,000 rpm离心10分钟，取上清。 注）此时4℃离心不利于沉淀沉降。 7. 将试剂盒中的Spin Column（离心柱）安置于Collection Tube （收集管）上。 8. 将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 六、实验作业 按上述实验步骤提取质粒DNA。 思考本实验的关键步骤是什么？ 答：本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分，溶液Ⅲ混合须温和。用binding buffer是为了增加洗脱柱对核酸的结合活性；wash solution是洗掉柱子里除核酸物质以外的杂质；而elution buffer就是最后把DNA从柱子上洗脱下来使用的溶液，一般是pH=8.0的TE，dd水也可以。 实验二 大肠杆菌的遗传转化 一、实验目的 通过实验了解原核生物实现基因转移的途径，掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。 二、实验原理 转化（transformation）是指一种生物由于接受了另一种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。 目前应用较广的转化方法有两种：CaCl2转化法（化学转化法）和电转化法。 CaCl2转化法的原理是在低温（0℃）和低渗的CaCl2溶液中，菌体膨胀，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经42℃短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物。 三、实验材料 质粒pGEM-T easy ：编码氨苄青霉素（Ampr）的抗性基因 大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株：氨苄青霉素敏感型（Amp-） 四、实验用品 超净工作台、摇床 水浴锅、离心机 分光光度计、移液器及枪头 三角瓶（500mL、200mL） 离心管（50mL、1.5mL） 平板（Ampr、Amp-）、LB培养基 冰冷的CaCl2溶液、质粒DNA 0.1M CaCl2溶液配制： 称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml双蒸水中，高压灭菌或0.22um滤器过滤除菌。保存于4度冰箱中。 质粒的提取： 利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。 五、实验步骤 （一）感受态的制备(此步骤已完成） 1、E. Coli涂布于平板（Amp-），37℃，培养12h； 2、挑取单菌落，转移至盛有200mL LB的500mL三角瓶中，37℃，振荡（200r/min）培养12h； 3、吸取1mL菌液，转移至盛有100mL LB