6生物分离(工程)技术(第六章沉淀与膜分离技术1).pptVIP

②盐析曲线的制作(设操作温度为0℃) (1)将料液分成等体积的数份； (2)计算达到10％--100％饱和度所需加入的硫酸铵量，并在搅拌下分别加到料液中，搅拌1h，静置1h以上； (3)离心（3000rpm）40min后，将沉淀溶于缓冲溶液中，测定其中总蛋白和目标蛋白的浓度； (4)分别测上清液中总蛋白和目标蛋白的浓度，比较沉淀前后蛋白质是否保持物料守恒，检验结果的可信度； (5)以饱和度为横坐标，上清液中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标作图。 盐析曲线图 ③分步盐析法 4、盐析操作必须注意的问题 中性盐的纯度要高、溶解要充分； 盐析常与等电点沉淀相结合； 选择适当的沉淀温度； 选择适当的蛋白质浓度； 饱和硫酸铵要现配现用； 盐析产品需脱盐后进一步纯化。 等电点沉淀 三、有机溶剂沉淀 1、有机溶剂沉淀的机理 2、有机溶剂的选择与用量 3、温度和pH对有机溶剂沉淀的影响 4、有机溶剂沉淀时应注意的问题 1、有机溶剂沉淀的机理 降低溶液的介电常数， 如：20℃时，水的介电常数为80，82%的乙醇的介电常数为40。 破坏蛋白质胶体分子的水化膜， 破坏蛋白质分子的次级键，使疏水基团暴露，形成疏水层。 2、有机溶剂的选择与用量 丙酮＞乙醇＞甲醇 乙醇的稀释 有机溶剂用量的计算 有机溶剂沉淀曲线 乙醇的稀释 有机溶剂用量的计算 V=V0(S2-S1)/(100-S2) V＝需加入有机溶剂的体积； V0＝蛋白溶液的原始体积； Sl＝蛋白溶液中有机溶剂的浓度； S2＝蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度。 3、温度和pH对有机溶剂沉淀的影响 4、有机溶剂沉淀时应注意的问题 低温下操作 中性盐的盐溶作用可减少变性 多价阳离子可降低蛋白质的溶解度 防止过量有机溶剂引起共沉淀 沉淀应尽快分离，并溶于缓冲液中 四、热 沉 淀 根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。 热沉淀是一种变性分离法，带有一定的冒险性，使用时需对目标产物和共存杂蛋白的热稳定性有充分的了解。 五、其他沉淀法 非离子型聚合物聚乙二醇(PEG)是蛋白质稳定剂，也可促进蛋白质的沉淀。 聚电解质有酸性多糖和羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐和卡拉胶等常用于回收食品蛋白 某些金属离子可与蛋白质分子上的某些残基发生相互作用而使蛋白质沉淀。 例如，Ca2+和Mg2+能与羧基结合，Mn2+和Zn2+能与羧基、含氮化合物(如胺)以及杂环化合物结合。 非离子型聚合物沉淀法 降低水化度，使蛋白质沉淀。 PEG的优点是无毒，不可燃烧，且对大多数蛋白质有保护作用， 最常用的PEG是4000 、6000和20000，所用的PEG浓度通常小于20%浓度，再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。 蛋白质溶解度与PEG浓度之间的关系 式中S为PEG存在是的溶解度，So为无PEG时的溶解度，K是常数，与蛋白质和分子量的大小有关。 六、思考题 1、盐析沉淀中KS分段盐析和β分段盐析有何区别？ 2、饱和(NH4)2SO4溶液怎样配制？在25℃时，在每升溶液中加入767克硫酸铵克达到100%饱和度。怎样使溶液达50%饱和度？ 3、含25%硫酸铵饱和度的蛋白质溶液150ml,须加多少克硫酸铵或多少毫升饱和硫酸铵溶液，才能使其达55%饱和度？ 4、盐析和有机溶剂沉淀在机理上有和异同，在操作上应注意那些问题？ 稍息 * * 蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。即使如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成 * * * * * * 生物分离(工程)技术 生物分离（工程）技术 主讲：吴元喜 E-mail: wuyuanxi@mail.hust.edu.cn 联系电话：027 2010年8月 生物工业下游技术一般工艺过程 第六章沉淀分离技术 一、蛋白质的表面特性 二、盐析沉淀 三、有机溶剂沉淀 四、热 沉 淀 五、其他沉淀法 六、思考题 沉淀的含义 沉淀结晶：是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。 沉淀是不定形的固体颗粒，构成成分复杂，除含有目标分子外，还夹杂共存的杂质、盐和溶剂，其纯度远低于结晶。 沉淀法是采取适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液中各种成分的溶解度，使溶液中的欲提取目标物和杂质分开的技术，所以也称溶解度法。 沉淀法是一种初级分离